富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊羔羊生長性能、血清指標(biāo)和消化功能的影響

程連平 賀濛初 夏曉冬 李曼曼 舒迎霜 彭成璐 馮士彬 王希春 李 玉 吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，地方畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種安徽省重點實驗室，合肥 230036)

目前，我國養(yǎng)殖場抗生素的使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷增加，造成養(yǎng)殖動物的抗病性降低、畜產(chǎn)品藥物殘留等問題，嚴(yán)重制約了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，在畜禽生產(chǎn)中開發(fā)綠色安全、高效、無殘留的抗生素替代品已成為研究熱點和必然趨勢。

微生態(tài)制劑，是利用正常微生物或促進(jìn)微生物生長的物質(zhì)制成的。微生態(tài)制劑因其在動物體內(nèi)無殘留，并且可以改善動物健康，提高生產(chǎn)力和免疫力，逐步被廣泛應(yīng)用[1]。飼糧中添加富硒酵母可以提高育肥豬生長性能、養(yǎng)分表觀消化率和抗氧化能力[2]?？莶菅挎邨U菌能夠改善動物腸道微生物的生存環(huán)境，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的充分吸收，提高飼糧的利用率，降低成本[3]?？莶菅挎邨U菌還可以提高動物機體抵抗力，為其他有益菌創(chuàng)造更好生長和繁殖的條件從而改善腸道菌群，通過抑制致病菌生長提高動物機體的免疫力[4]。

湖羊羔羊在斷奶后，由于應(yīng)激反應(yīng)明顯，不喜進(jìn)食開食料和代乳品等，導(dǎo)致生長遲緩、腹瀉等的發(fā)生。關(guān)于富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊羔羊的研究報道較少。因此，本試驗擬以45日齡的湖羊斷奶羔羊為試驗動物，通過在飼糧中添加富硒酵母和枯草芽孢桿菌，探討其對湖羊斷奶羔羊生長性能、血清指標(biāo)、養(yǎng)分表觀消化率、胰腺消化酶活性和瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，為微生態(tài)制劑在羊生產(chǎn)中的科學(xué)應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試驗動物

試驗所用枯草芽孢桿菌制劑購自株洲智薈生物科技有限公司，有效活菌數(shù)為1×1010CFU/g；富硒酵母購自安琪酵母有限公司，硒含量為2 000 mg/kg。試驗動物為45日齡湖羊斷奶羔羊。基礎(chǔ)飼糧和試驗動物皆由安徽省馬鞍山市金農(nóng)牧業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗設(shè)計

選取21只45日齡體況良好、平均體重為(9.65±0.38) kg的湖羊斷奶羔羊，隨機分為3組，即對照組、富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組，每組7只。試驗期28 d。參照《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》NY/T 816—2004配制飼糧，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組在基礎(chǔ)飼糧的精料中分別添加100 g/t富硒酵母和100 g/t枯草芽孢桿菌制劑?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1)每千克預(yù)混料含有 One kg of the premix contained the following:VA 120 000 IU，VD360 000 IU，VE 1 900 mg，煙酸 niacin 360 mg，Zn 1.8 g，Cu 0.22 g，Mn 2.0 g，Ca 150 g，P 15 g，NaCl 75 g。
2)鈣、磷為計算值，參照《動物營養(yǎng)參數(shù)與飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》[5]計算，其他營養(yǎng)水平為實測值。Ca and P were calculated values, which were calculated in reference toNutritionParametersandFeedingStandardforAnimals[5], while the other nutrient levels were measured values.

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在安徽省馬鞍山市金農(nóng)牧業(yè)有限公司羊場進(jìn)行，在預(yù)飼時免疫注射三聯(lián)四防疫苗，并注射伊維菌素溶液(0.2 mg/kg)進(jìn)行驅(qū)蟲處理。每7只羊為l圈飼養(yǎng)，保證有足夠運動空間，每天定時投喂精料和粗料。每天根據(jù)前1天料盆內(nèi)剩余料重新調(diào)整飼喂量，保證其自由采食和飲水，定期消毒。

1.4 樣品采集與指標(biāo)測定方法

1.4.1 生長性能

每天準(zhǔn)確記錄每組羔羊采食量，觀察羔羊生長情況，分別于試驗期第1、7、14、21、28天稱量每只羔羊體重，并計算精料平均日采食量、粗料平均日采食量、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.4.2 血清生化指標(biāo)

分別于試驗期第1、14、28天08：00，對所有羔羊空腹進(jìn)行頸靜脈采血10 mL，靜置30 min，以3 000 r/min離心，收集血清，置于-20 ℃保存待測。采用邁瑞B(yǎng)SL-220全自動生化分析儀進(jìn)行血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)活性及總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿素(UREA)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量的測定。血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)的含量均采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測完成，試劑盒由南京森貝伽生物科技有限公司提供，具體步驟參照說明書。

1.4.3 養(yǎng)分表觀消化率

在試驗期最后3 d，每組隨機選取3只羔羊進(jìn)行消化代謝試驗，每組羔羊為同一料盆飼喂，根據(jù)剩料量，準(zhǔn)確計算采食量。采用直腸取糞法收集糞樣，所收集到的鮮糞準(zhǔn)確稱重，混勻，取總重量的20%作為樣品，并按100 mL/kg加入10%的鹽酸，置于-20 ℃保存。在65 ℃條件下烘干48 h，粉碎后置于室溫下回潮24 h，裝于樣品袋中備用，飼糧和糞便樣品中的干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量測定分別按照GB/T 6435—2006、GB/T 6432—1994、GB/T 6433—2006、GB/T 20806—2006、NY/T 1459—2007的方法進(jìn)行。

養(yǎng)分表觀消化率(%)=100×(飼糧采食量×飼糧養(yǎng)分含量—日排糞量×糞便養(yǎng)分含量)/(飼糧采食量×飼糧養(yǎng)分含量)。

1.4.4 胰腺消化酶活性

在試驗期結(jié)束空腹稱重后每組隨機屠宰3只，按《家畜解剖及組織胚胎學(xué)》[6]方法采集胰腺，準(zhǔn)確稱量并記錄重量。從頭、體、尾3個部位取0.2 g左右的胰臟樣本，加入1.8 mL生理鹽水用高速勻漿機配成10%的組織勻漿，經(jīng)2 500 r/min 4 ℃離心15 min，取上清液備用。胰腺淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性均采用試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)進(jìn)行測定，測定方法參照說明書進(jìn)行。淀粉酶活性單位定義為：在37 ℃條件下，樣品中每毫克組織蛋白質(zhì)與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個活性單位(U/mg)；脂肪酶活性單位定義為:在37 ℃條件下，樣品中每毫克組織蛋白質(zhì)與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為1個活性單位(U/mg)；糜蛋白酶活性單位定義為:在37 ℃條件下，樣品中每毫克組織蛋白質(zhì)每分鐘分解蛋白質(zhì)生產(chǎn)1 μg氨基酸定義為1個活性單位(U/mg)。

1.4.5 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

在試驗期結(jié)束后每組隨機屠宰3只收集瘤胃液，用3層紗布過濾，1 500 r/min離心15 min，取上清液于-20 ℃保存待測。

瘤胃液氨態(tài)氮(NH3-N)的含量的測定采用改進(jìn)的比色法[7]測定。瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量采用氣相色譜儀-質(zhì)譜儀(GCMS ISQ LT)檢測[色譜柱(TG WAX，30 m×0.25 mm，0.25 μm)；自動進(jìn)樣器TriPlus RSH；檢測器MS isq。標(biāo)準(zhǔn)品包括：乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸、正戊酸標(biāo)準(zhǔn)品]。

色譜條件:載氣氦氣(恒流模式、總流量0.8 mL/min)；進(jìn)樣口溫度200 ℃；離子源溫度200 ℃；連接線溫度250 ℃；采用程序升溫，初始溫度120 ℃，6 min，以5 ℃/min的速率升溫至150 ℃，運行2 min；進(jìn)樣量為1 μL;分流比75∶1;質(zhì)譜：EI源；轟擊電壓：70 eV；單離子掃描模式：定量離子60、73。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用LSD法進(jìn)行多重比較，試驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，分別以P<0.05和P<0.01作為差異顯著和極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊羔羊生長性能的影響

由表2可以看出，各組始重差異不顯著(P>0.05)。與對照組相比，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組羔羊的末重極顯著提高(P<0.01)，平均日增重顯著提高(P<0.05)，精料和粗料平均日采食量變化均不顯著(P>0.05)，但是精料和粗料的料重比顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

2.2 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊羔羊血清指標(biāo)的影響

由表3和表4可以看出，第28天，與對照組相比，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組的血清ALB、GLB、TP、TC、TG、UREA含量及ALT、AST、ALP、LDH活性無顯著變化(P>0.05)；富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組血清IgA、IgG、IgM、IL-6的含量顯著提高(P<0.05)，血清GSH-Px活性極顯著提高(P<0.01)；富硒酵母組血清MDA含量顯著降低(P<0.05)，血清IL-1含量顯著升高(P<0.05)，血清SOD活性極顯著提高(P<0.01)；枯草芽孢桿菌組的血清IL-2含量極顯著提高(P<0.01)，血清IFN-γ含量顯著提高(P<0.05)。

表2 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對羔羊生長性能的影響Table 2 Effects of selenium-enriched yeast and Bacillus subtilis on growth performance of lambs

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。
In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

表3 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對羔羊血清生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of selenium-enriched yeast and Bacillus subtilis on serum biochemical indices of lambs

續(xù)表3項目Items時間Time/d對照組Control group富硒酵母組Selenium-enriched yeast group 枯草芽孢桿菌組Bacillus subtilis group尿素 UREA/(mmol/L)15.46±1.074.75±1.775.59±1.18147.00±1.335.98±1.437.31±1.69287.73±0.867.29±1.207.95±1.30堿性磷酸酶 ALP/(U/L)1413.14±52.54408.37±50.59395.94±98.5214509.43±167.83449.33±99.15480.87±115.8428451.64±133.57377.31±132.43414.16±263.37

表4 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對羔羊血清免疫和抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of selenium-enriched yeast and Bacillus subtilis on serum immunological and antioxidant indices of lambs

2.3 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊羔羊養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表5可知，相比對照組，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組的粗蛋白質(zhì)、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維表觀消化率顯著提高(P<0.05)，干物質(zhì)的表觀消化率極顯著提高(P<0.01)；枯草芽孢桿菌組的粗脂肪表觀消化率顯著提高(P<0.05)。

表5 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對羔羊養(yǎng)分表觀消化率的影響Table 5 Effects of selenium-enriched yeast and Bacillus subtilis on nutrient apparent digestibility of lambs %

2.4 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊羔羊胰腺消化酶活性的影響

由表6可知，與對照組相比，枯草芽孢桿菌組胰腺脂肪酶活性和富硒酵母組胰腺胰蛋白酶活性均顯著提高(P<0.05)，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組胰腺淀粉酶活性變化不顯著(P>0.05)，但在數(shù)值上略有升高。

表6 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對羔羊胰腺消化酶活性的影響Table 6 Effects of selenium-enriched yeast and Bacillus subtilis on digestive enzyme activities in pancreas of lambs U/mg

2.5 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊羔羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表7可知，與對照組相比，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組羔羊瘤胃液NH3-N、乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸含量顯著提高(P<0.05)；富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組瘤胃液的異戊酸、正戊酸含量變化不顯著(P>0.05)，但在數(shù)值上略有提高。

表7 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對羔羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 7 Effects of selenium-enriched yeast and Bacillus subtilis on rumen fermentation parameters of lambs

3 討 論

3.1 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊羔羊生長性能的影響

微生態(tài)制劑可以促進(jìn)多種在腸道消化吸收中占主導(dǎo)地位的厭氧菌的生長繁殖，從而促進(jìn)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝吸收，提高機體的生長性能。Shi等[8]研究發(fā)現(xiàn)，添加酵母硒可以顯著提高太白黑羊羔羊的的生長性能。Stewart[9]研究發(fā)現(xiàn)在母羊飼糧中添加富硒酵母能夠顯著提高羔羊的平均日增重。仇武松等[10]研究結(jié)果表明，在飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以降低羔羊的料重比，從而提高生長性能。本試驗研究結(jié)果與上述報道一致。然而，也有試驗結(jié)果顯示，微生態(tài)制劑對畜禽的生長性能沒有顯著影響[11]。不同的研究結(jié)果存在差異，主要是可能與微生態(tài)制劑的菌種特性、添加比例以及動物的日齡、生理狀態(tài)和營養(yǎng)因素有關(guān)。從本試驗結(jié)果來看，飼糧中添加富硒酵母和枯草芽孢桿菌能夠降低料重比，顯著提高羔羊的生長性能。但如何發(fā)揮其最佳使用效果，還需對微生態(tài)制劑的添加劑量和使用階段進(jìn)一步研究確定。

3.2 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊羔羊血清指標(biāo)的影響

本試驗對照組、富硒酵母組、枯草芽孢桿菌組之間的血清TP、ALB、GLB含量及ALT、AST活性無顯著性差異，說明微生態(tài)制劑對湖羊血清中的蛋白質(zhì)含量無顯著影響。細(xì)胞因子是免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子，能夠影響免疫應(yīng)答的類型和水平[12]。王蘭惠[13]的研究發(fā)現(xiàn)給綿羊灌注酵母培養(yǎng)物能夠提高血清IgA、IgG和IL-6的含量，顯著提高血清IL-2、IFN-γ含量。Rajput等[14]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可以提高紹興鴨血清中IL-2的含量。Hall等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛飼糧中補硒后可增加奶牛血清中的IgG含量。在本試驗中富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組血清中IgA、IgG和IgM均顯著高于對照組，這表明微生態(tài)制劑可以提高羔羊機體的免疫力。

血清中GSH-Px和SOD活性是反映動物機體抗氧化能力的重要指標(biāo)。劉強等[16]研究發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加富硒酵母能夠顯著提高血清GSH-Px、SOD活性，顯著降低血清MDA含量。Faixová等[17]在飼糧中添加富硒酵母，顯著提高了羊血清GSH-Px活性。任民等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加枯草芽孢桿菌能夠顯著提高血清GSH-Px活性，顯著降低血清MDA含量。本試驗中，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組羔羊血清中的GSH-Px和SOD活性也顯著提高,血清MDA含量顯著下降，這表明富硒酵母和枯草芽孢桿菌能夠提高湖羊羔羊的抗氧化能力。

3.3 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊羔羊養(yǎng)分表觀消化率和胰腺消化酶活性的影響

國內(nèi)外的一些研究表明，在畜禽飼糧中合理添加富硒酵母和枯草芽孢桿菌可以顯著提高營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率。張麗娟等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加富硒酵母能夠提高酸性洗滌纖維的表觀消化率。Molnár等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加枯草芽孢桿菌夠提高飼料轉(zhuǎn)化效率。Cho等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在豬飼糧中添加枯草芽孢桿能夠提高飼糧蛋白質(zhì)消化率。微生態(tài)制劑在腸道內(nèi)產(chǎn)生的消化酶和促生長因子等活性物質(zhì)，可協(xié)同增強對養(yǎng)分的消化和吸收。本試驗中，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組羔羊養(yǎng)分表觀消化率也顯著提升。但是，也有微生態(tài)制劑的試驗發(fā)現(xiàn)沒有對養(yǎng)分消化產(chǎn)生影響[22]，這或許與不同的養(yǎng)殖管理模式有關(guān)。

淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶作為3類主要的胰消化酶，經(jīng)胰液分泌與電解質(zhì)一起進(jìn)入近端小腸中,在蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物的消化中起重要的作用[23]。劉翠玲等[24]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可以顯著提高鯉幼魚胰臟蛋白酶、后腸淀粉酶的活性。李衛(wèi)芬等[25]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可以顯著提高草魚胰臟中脂肪酶和胰蛋白酶活性。本試驗中，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組胰蛋白酶和脂肪酶活性有顯著提高，說明對湖羊羔羊消化功能有促進(jìn)作用。

3.4 富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊羔羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃液NH3-N是飼糧中多種蛋白質(zhì)在瘤胃發(fā)酵的重要產(chǎn)物，能夠為大約50%的瘤胃微生物合成菌體蛋白質(zhì)提供氮源。反芻動物瘤胃液NH3-N含量正常數(shù)值范圍一般維持在6.3～27.0 mg/dL[26]。周傳社等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧添加酵母培養(yǎng)物可以提高山羊瘤胃液NH3-N含量，對于調(diào)節(jié)山羊瘤胃發(fā)酵有促進(jìn)作用。鄧露芳[28]研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛飼糧添加納豆枯草芽孢桿菌能夠提高瘤胃液NH3-N含量，這也說明枯草芽孢桿菌改善瘤胃發(fā)酵參數(shù)。反芻動物瘤胃對養(yǎng)分的消化吸收以及微生物動力學(xué)過程中可產(chǎn)生大量的揮發(fā)性脂肪酸，其主要作用為供能和維持瘤胃環(huán)境。朱翱翔等[29]研究發(fā)現(xiàn)，酵母硒可以提高湖羊母羊瘤胃液中乙酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量，從而促進(jìn)瘤胃發(fā)酵。研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可以提高奶牛瘤胃液NH3-N、總揮發(fā)性脂肪酸的含量，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵[30-31]。本試驗中，富硒酵母組和枯草芽孢桿菌組羔羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)得到改善，說明富硒酵母和枯草芽孢桿菌對湖羊瘤胃發(fā)酵有促進(jìn)作用。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加富硒酵母和枯草芽孢桿菌能夠提高斷奶湖羊羔羊的平均日增重，降低料重比。

② 飼糧中添加富硒酵母和枯草芽孢桿菌能夠提高斷奶湖羊羔羊血清中免疫球蛋白含量和抗氧化酶活性。

③ 飼糧中添加富硒酵母和枯草芽孢桿菌能夠提高斷奶湖羊羔羊?qū)︷B(yǎng)分的表觀消化率、胰腺消化酶活性和瘤胃發(fā)酵參數(shù)，從而提高消化功能。