賴氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)和蛋白磷酸化的影響

陳 璐 趙艷麗 郭曉宇 史彬林 閆素梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

乳蛋白是牛奶的主要成分，是評(píng)價(jià)牛奶質(zhì)量的重要指標(biāo)。氨基酸(amino acid，AA)是合成乳蛋白的主要前體物，可以影響乳蛋白合成[1]。賴氨酸(lysine，Lys)是乳蛋白合成主要的必需氨基酸(essential amino acid，EAA)，也是奶牛的限制性氨基酸。因此，深入研究Lys對(duì)乳蛋白合成的影響及機(jī)理，對(duì)調(diào)節(jié)乳腺內(nèi)乳成分的合成和改善乳品質(zhì)具有重要意義。李沐陽(yáng)等[2]研究發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈飼糧條件下奶牛陰外動(dòng)脈灌注氨基酸能促進(jìn)乳蛋白合成。王立娜[3]以奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells，BMECs)為模型在培養(yǎng)基中添加EAA發(fā)現(xiàn)，乳蛋白的合成量增加了。Giallongo等[4]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛灌注過(guò)瘤胃Lys后促進(jìn)乳蛋白合成的同時(shí)，也改善了乳品質(zhì)。可見(jiàn)，Lys在一定程度上影響了乳蛋白的合成，但前人的研究多集中在向奶牛體內(nèi)灌注Lys影響乳蛋白合成的方面，對(duì)體外添加Lys影響乳蛋白合成及其機(jī)理方面的探索研究甚少，有必要對(duì)此進(jìn)行深入試驗(yàn)研究。鑒于此，本研究以BMECs為模型，研究不同濃度Lys對(duì)乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)和蛋白磷酸化的影響，為進(jìn)一步探討Lys對(duì)BMECs內(nèi)乳蛋白合成的影響機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Ⅱ型膠原酶、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)自Gibco公司；Lys(貨號(hào)L8662)、氫化可的松、表皮生長(zhǎng)因子、催乳素、瓊脂糖購(gòu)自Sigma公司；RNAiso PLUS、PrimeScript RT Master Mix和SYBR Premix ExTaqTMⅡ購(gòu)自TaKaRa公司；兔抗哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抗體(貨號(hào)ab2732)、兔抗磷酸化mTOR抗體(貨號(hào)ab84400)、兔抗真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)抗體(貨號(hào)ab72116)、兔抗磷酸化eIF4E抗體(貨號(hào)ab4774)、兔抗p70核糖體蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1)抗體(貨號(hào)ab64804)、兔抗磷酸化S6K1抗體(貨號(hào)ab126818)、兔抗真核起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic initiation 4E binding protein 1，4EBP1)抗體(貨號(hào)ab2606)、兔抗磷酸化4EBP1抗體(貨號(hào)ab75767)購(gòu)自Abcam公司；兔抗磷酸腺苷活化的蛋白激酶α1(adenosine 5’-mono-phpsphate-active protein kinase，AMPKα1)抗體(貨號(hào)YT0216)和兔抗磷酸化AMPKα1抗體(貨號(hào)YP0575)購(gòu)自Immunoway公司；一抗稀釋液、二抗稀釋液、十二烷基四乙酸二鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)電泳液、轉(zhuǎn)膜液、ECL化學(xué)超敏顯色液購(gòu)自北京碧云天公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗(貨號(hào)04-15-06)購(gòu)自KPL公司。主要儀器：全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Synergy H4，美國(guó)BioTek)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI-7500，美國(guó)ABI)、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、蛋白成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD)。

1.2 原代BMECs的體外培養(yǎng)與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市北亞清真屠宰場(chǎng)選取3頭3～5歲經(jīng)產(chǎn)的健康泌乳中期的高產(chǎn)荷斯坦奶牛乳腺組織，參考Sheng等[5]采用的膠原酶消化法獲得和培養(yǎng)BMECs，當(dāng)原代細(xì)胞貼壁率達(dá)到80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶/EDTA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化和傳代。將第3代BMECs按照試驗(yàn)要求的細(xì)胞密度接種于不同細(xì)胞培養(yǎng)板上，于37、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞貼壁率達(dá)到80%～90%時(shí)，換為饑餓培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后，采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將細(xì)胞分為6組，在每組中加入不同濃度的Lys工作液，使反應(yīng)體系中Lys終濃度分別為0.5(對(duì)照)、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mmol/L，每組6個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)48 h。DMEM/F12培養(yǎng)基中Lys的濃度為0.5 mmol/L，Lys的濃度參考高海娜[6]和李喜艷[7]的研究結(jié)果，并通過(guò)測(cè)定細(xì)胞相對(duì)增殖率[相對(duì)增殖率(%)=(試驗(yàn)組OD490 nm/對(duì)照組OD490 nm)×100]確定。

1.3 測(cè)試指標(biāo)與方法

BMECs內(nèi)ATP的含量采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定。將細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板上，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清，每孔加入200 μL裂解液，待細(xì)胞充分裂解后，收集細(xì)胞懸液，4 ℃、15 455×g離心5 min，取上清，立即根據(jù)ATP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行測(cè)定，即用ATP檢測(cè)裂解液將ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00和10.00 μmol/L 6個(gè)濃度；然后，用ATP檢測(cè)試劑稀釋液將ATP檢測(cè)試劑按1∶9的比例稀釋成ATP檢測(cè)工作液；最后，在每個(gè)檢測(cè)孔內(nèi)加入100 μL ATP檢測(cè)工作液，室溫靜置3～5 min，再向每孔內(nèi)加入20 μL樣品，迅速混勻后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定Lum值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品ATP濃度，用二辛可酸(BCA)蛋白質(zhì)濃度試劑盒測(cè)樣品中蛋白質(zhì)濃度，將ATP濃度換算成nmol/mg prot形式。

BMECs內(nèi)總RNA按照Trizol法提取。將細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)總RNA的純度與濃度，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.2表示提取的RNA純度較好?？俁NA完整性用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用PrimeScript RT Master Mix試劑盒的方法進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL?；虮磉_(dá)量采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒的方法進(jìn)行測(cè)定，反應(yīng)體系為20 μL。以磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為管家基因，對(duì)乳蛋白合成相關(guān)基因[α-酪蛋白(αs1-casein，CSN1S1)、β-酪蛋白(β-casein，CSN2)、κ-酪蛋白(κ-casein，CSN3)、酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(signaltransducer and activator of transcription 5，STAT5)、mTOR、S6K1、4EBP1、eIF4E和AMPKα1]的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，其引物序列見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5.0 ℃預(yù)變性30 s；95.0 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s，51個(gè)循環(huán)，繪制熔解曲線?；虻谋磉_(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

表1 乳蛋白合成相關(guān)基因的引物Table 1 Primers of genes involved in milk protein synthesis

BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)的蛋白磷酸化水平采用蛋白質(zhì)免疫印跡法測(cè)定。將細(xì)胞以5×106個(gè)/瓶的密度接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2遍，每瓶加入250 μL含0.1%苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)細(xì)胞裂解液，4 ℃裂解5 min后刮下細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，4 ℃、15 455×g離心10 min，取上清用于檢測(cè)蛋白磷酸化水平。取適量樣品用BCA法測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度，隨后分別向60 μg的每種樣品中添加5×蛋白上樣緩沖液，按照4∶1的質(zhì)量體積比混合，100 ℃加熱5 min使蛋白質(zhì)熱變性，然后按照蛋白質(zhì)免疫印跡法的步驟進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜；將轉(zhuǎn)膜后的醋酸纖維素(PVDF)膜分別與用一抗稀釋液稀釋500倍的一抗結(jié)合，于4 ℃孵育過(guò)夜，隨后使其分別與用二抗稀釋液稀釋1 000倍的山羊抗兔二抗結(jié)合，室溫?fù)u床孵育1 h；最后用ECL化學(xué)超敏顯色液進(jìn)行顯色，在蛋白成像系統(tǒng)上照相分析。圖片用Quantity one軟件進(jìn)行灰度值分析，各蛋白磷酸化水平數(shù)據(jù)采用各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比的方法表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件的方差分析程序(ANOVA)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，同時(shí)用回歸統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行一次線性與二次曲線回歸分析，P<0.05表示組間的差異或回歸關(guān)系顯著，0.05≤P<0.10表示組間的差異或回歸關(guān)系趨于顯著，P≥0.10表示組間的差異或回歸關(guān)系不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 Lys對(duì)BMECs內(nèi)ATP含量及乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表2可知，BMECs內(nèi)RGR呈顯著的一次線性下降(P<0.001)，并且4.0～16.0 mmol/L組的RGR顯著低于對(duì)照組和1.0～2.0 mmol/L組(P<0.05)；ATP含量以2.0～16.0 mmol/L組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，2.0 mmol/L組最高，回歸分析結(jié)果顯示，隨著Lys濃度的增加，ATP含量呈趨于顯著的二次曲線升高(P=0.050)。隨著Lys濃度的增加，CSN1S1基因表達(dá)量呈趨于顯著的一次線性降低(P=0.081)；以1.0～2.0 mmol/L組顯著高于其他組(P<0.05)，尤以2.0 mmol/L組最高，但4.0～16.0 mmol/L組顯著低于對(duì)照組和1.0～2.0 mmol/L組(P<0.05)。1.0～2.0 mmol/L組的CSN2和STAT5基因表達(dá)量顯著高于其他組(P<0.05)，以2.0 mmol/L組最高，但CSN2以8.0 mmol/L組最低，STAT5以4.0～16.0 mmol/L組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；1.0～16.0 mmol/L組的JAK2基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。CSN3(P=0.093)、mTOR(P=0.005)、eIF4E(P=0.076)和AMPKα1基因表達(dá)量(P=0.045)隨著Lys濃度的增加呈顯著或趨于顯著的二次曲線變化，均為先升高后降低。CSN3基因表達(dá)量以1.0～4.0 mmol/L組顯著高于其他組，但8.0～16.0 mmol/L組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，mTOR基因表達(dá)量以對(duì)照組和1.0～8.0 mmol/L組顯著高于16.0 mmol/L組(P<0.05)，eIF4E基因表達(dá)量以2.0～8.0 mmol/L組顯著高于其他各組(P<0.05)，AMPKα1基因表達(dá)量以1.0～8.0 mmol/L組顯著高于其他組(P<0.05)。2.0 mmol/L組的S6K1基因表達(dá)量最高，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，以16.0 mmol/L組最低。對(duì)于4EBP1的基因表達(dá)量，1.0～16.0 mmol/L組較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。

表2 Lys對(duì)BMECs內(nèi)ATP含量和乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響Table 2 Effects of Lys on ATP content and the expression levels of genes involved in milk protein synthesis in BMECs

續(xù)表2項(xiàng)目ItemsLys濃度 Lys concentration/(mmol/L)0.51.02.04.08.016.0SEM方差分析P值P-value for ANOVAP值P-value一次Linear二次Quadratic真核起始因子4E結(jié)合蛋白14EBP11.00a0.58c0.75b0.58c0.85b0.71bc0.042<0.0010.9880.998哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 mTOR1.00a1.06a1.04a1.00a0.98a0.71b0.0650.0070.0060.005p70核糖體蛋白S6激酶1 S6K11.00b1.09ab1.28a1.10ab1.07b0.93b0.0600.0050.2420.427磷酸腺苷活化的蛋白激酶α1 AMPKα11.00e1.24d1.54c2.00a1.77b0.85e0.071<0.0010.6120.045

SEM表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。同行數(shù)據(jù)相同或無(wú)字母肩標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母肩標(biāo)表示差異顯著(P<0.05)。P<0.05表示回歸關(guān)系顯著；0.05≤P<0.10表示回歸關(guān)系趨于顯著；P≥0.10表示回歸關(guān)系不顯著。下表同。
SEM means standard error of the mean. Values of the same row with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05).P<0.05 means significant regression. 0.05≤P<0.10 means that the regression tends to be significant.P≥0.10 means no significant regression. The same as below.

2.2 Lys對(duì)乳蛋白合成相關(guān)蛋白磷酸化的影響

由表3和圖1可知，隨著Lys濃度的增加，mTOR(P=0.038)和S6K1磷酸化水平(P=0.022)呈顯著的一次線性降低。eIF4E的磷酸化水平以2.0～4.0 mmol/L組較高，顯著高于其他各組(P<0.05)，但16.0 mmol/L組與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平隨著Lys濃度的增加呈顯著的一次線性升高(P=0.014)。

表3 Lys對(duì)BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)蛋白磷酸化水平的影響Table 3 Effects of Lys on phosphorylation levels of proteins involved in milk protein synthesis in BMECs

括號(hào)內(nèi)為磷酸化位點(diǎn)。Phosphorylation sits were showed in parentheses.

3 討 論

酪蛋白在牛乳蛋白中大約占80%，它主要包括CSN1S1、αs2-酪蛋白(αs2-casein，CSN1S2)、CSN2和CSN3，尤以CSN1S1和CSN2的含量較高，分別為40%和25%左右[9]。CSN1S1、CSN2和CSN3是反映乳蛋白合成的3個(gè)主要基因，其表達(dá)量會(huì)影響B(tài)MECs內(nèi)乳蛋白的合成。Nan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，與0 mmol/L的Lys組相比，1.2 mmol/L的Lys組顯著的上調(diào)了BMECs內(nèi)CSN1S1、CSN2和CSN3基因的表達(dá)。本研究結(jié)果得出，Lys顯著促進(jìn)了CSN1S1、CSN2和CSN3基因表達(dá)，均以1.0～2.0 mmol/L組促進(jìn)效果較好，且Lys對(duì)CSN3和CSN1S1基因表達(dá)的促進(jìn)效果呈劑量依賴關(guān)系，高劑量的16.0 mmol/L組顯著抑制其表達(dá)。

括號(hào)內(nèi)為磷酸化位點(diǎn)。Phosphorylation sits were showed in parentheses.
圖1Lys對(duì)BMECs內(nèi)mTOR信號(hào)通路磷酸化水平的影響
Fig.1 Effects of Lys on phosphorylation of mTOR signaling pathway in BMECs

酪氨酸激酶(JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)和mTOR信號(hào)通路是調(diào)控蛋白質(zhì)合成的2條重要通路[11-12]。JAK/STAT信號(hào)通路中，對(duì)乳蛋白合成調(diào)控的研究主要集中在JAK2/STAT5信號(hào)通路上。Liu等[13]研究指出，添加Lys可顯著提高BMECs內(nèi)STAT5基因表達(dá)量，然而STAT5沉默后CSN2基因表達(dá)量下降，過(guò)表達(dá)后上調(diào)其表達(dá)，說(shuō)明Lys可能通過(guò)JAK2/STAT5信號(hào)通路影響乳蛋白的合成。本研究發(fā)現(xiàn)，Lys可顯著促進(jìn)STAT5和JAK2基因表達(dá)，STAT5以2.0 mmol/L組促進(jìn)效果最好，但高劑量4.0～16.0 mmol/L組顯著抑制其表達(dá)，與Lys對(duì)酪蛋白基因表達(dá)的作用效果相似，進(jìn)一步驗(yàn)證了Lys可能通過(guò)JAK2/STAT5信號(hào)通路促進(jìn)乳蛋白的合成。

mTOR信號(hào)通路在蛋白質(zhì)翻譯水平上調(diào)控乳蛋白合成[12]。4EBP1和S6K1是mTOR信號(hào)通路下游的2個(gè)關(guān)鍵元件，當(dāng)mTOR被上游信號(hào)激活后會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)S6K1和4EBP1這2條下游通路來(lái)調(diào)控動(dòng)物機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的翻譯；然而4EBP1和elF4E的結(jié)合會(huì)抑制蛋白質(zhì)翻譯，當(dāng)mTOR激活4EBP1磷酸化后，磷酸化的4EBP1與elF4E脫離，降低了對(duì)蛋白質(zhì)翻譯的抑制，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。本研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的Lys促進(jìn)了mTOR、S6K1基因表達(dá)和eIF4E基因表達(dá)及磷酸化，但8.0～16.0 mmol/L組其促進(jìn)作用減弱或具有抑制作用。Lys濃度的增加抑制了4EBP1的基因表達(dá)，而對(duì)其磷酸化水平無(wú)顯著影響。畢微微[14]研究發(fā)現(xiàn)，添加Lys上調(diào)了BMECs內(nèi)mTOR信號(hào)通路中與乳蛋白翻譯相關(guān)的mTOR和S6K1基因表達(dá)，但下調(diào)了4EBP1基因的表達(dá)，與本研究的結(jié)果相似。這些研究結(jié)果提示Lys可能通過(guò)促進(jìn)mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)和磷酸化劑量依賴性地影響乳蛋白合成基因的表達(dá)。

氨基酸和ATP是蛋白質(zhì)合成過(guò)程中非常重要的2個(gè)因素，二者的供給直接影響乳品質(zhì)的高低。乳腺合成和分泌乳蛋白時(shí)需要大量的能量，大約會(huì)消耗掉BMECs內(nèi)約50%的ATP[15]。AMPK是細(xì)胞內(nèi)主要的能量感受器，參與多種代謝信號(hào)通路，調(diào)節(jié)機(jī)體代謝和能量的供需平衡[16]。AMPK還是mTOR信號(hào)通路的上游調(diào)控元件，負(fù)調(diào)控mTOR介導(dǎo)的下游信號(hào)通路[17]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP/一磷酸腺苷(AMP)降低或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏會(huì)激活A(yù)MPK，從而增加ATP的分解和減少ATP的合成[18-19]。因此，AMPK可以通過(guò)mTOR信號(hào)通路從蛋白質(zhì)翻譯水平來(lái)調(diào)控乳蛋白的合成。王珊珊[20]研究表明，隨著氨基酸濃度的下降細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量水平也下降了，進(jìn)而激活A(yù)MPK，抑制mTOR、S6K1和4EBP1的磷酸化，減少乳蛋白的合成。本研究發(fā)現(xiàn)，添加一定濃度的Lys在提高mTOR基因表達(dá)量及ATP含量的同時(shí)，也促進(jìn)了AMPKα1基因表達(dá)，但高劑量的16.0 mmol/L組反而顯著降低了mTOR和AMPKα1基因的表達(dá)量，與前人的研究結(jié)果不盡一致，造成這些結(jié)果差異的原因尚不清楚，需要進(jìn)一步探討。

本研究結(jié)果也得出，Lys濃度與ATP含量，CSN1S1、CSN3、mTOR、eIF4E和AMPKα1的基因表達(dá)量以及mTOR、S6K1和AMPK的磷酸化水平存在顯著或趨于顯著的劑量依賴關(guān)系，ATP含量以2.0～16.0 mmol/L組，CSN1S1、CSN2、STAT5基因表達(dá)量以1.0～2.0 mmol/L組，mTOR基因表達(dá)量以1.0～8.0 mmol/L組，CSN3基因表達(dá)量以1.0～4.0 mmol/L組，JAK2基因表達(dá)量以1.0～16.0 mmol/L組，S6K1基因表達(dá)量以2.0 mmol/L組，eIF4E基因表達(dá)量以2.0～8.0 mmol/L組，eIF4E磷酸化水平以2.0～4.0 mmol/L組時(shí)促進(jìn)效果較好；但16.0 mmol/L組的調(diào)節(jié)作用減弱或呈相反的變化趨勢(shì)。李喜艷[7]研究發(fā)現(xiàn)，雖然提高了BMECs培養(yǎng)基中個(gè)別氨基酸的添加量，但是會(huì)導(dǎo)致氨基酸配比不平衡進(jìn)而嚴(yán)重影響乳蛋白的合成，因此，高劑量Lys會(huì)抑制乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)可能與氨基酸配比不平衡有關(guān)。此外，Mercier等[21]的研究指出，BMECs的數(shù)量在某種程度上可能決定了乳蛋白的合成量，同時(shí)，高海娜等[22]研究也發(fā)現(xiàn)，添加0.5～2.0 mmol/L Lys促進(jìn)BMECs增殖，但高劑量會(huì)抑制其增殖，與本研究適宜濃度Lys促進(jìn)細(xì)胞增殖，而高劑量抑制其增殖的結(jié)果相似，進(jìn)一步解釋了高劑量Lys會(huì)抑制乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)。因此，Lys濃度為1.0～2.0 mmol/L時(shí)，對(duì)BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的促進(jìn)效果較好。

Brazil等[23]指出，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信號(hào)通路是調(diào)控mTOR信號(hào)通路非常重要的上游調(diào)控通路，對(duì)mTOR信號(hào)通路起正調(diào)控作用。還有研究指出，Akt可能通過(guò)結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物1(TSC1)/結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物2(TSC2)間接地調(diào)控mTOR信號(hào)通路[24]。這些結(jié)果說(shuō)明，Lys可能是通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控mTOR通路進(jìn)而促進(jìn)乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)，但本試驗(yàn)并未對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路進(jìn)行研究，具體調(diào)控機(jī)理尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

Lys對(duì)BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的促進(jìn)效果呈劑量依賴關(guān)系，以濃度為1.0～2.0 mmol/L時(shí)較好，高濃度(16.0 mmol/L) Lys抑制乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)，Lys可能通過(guò)JAK2/STAT5和mTOR信號(hào)通路促進(jìn)乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)。