基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的急性熱應(yīng)激肉雞血清物質(zhì)代謝組學(xué)研究

賀紹君 丁金雪 李 靜 胡 洪 劉德義

(安徽科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，滁州 233100)

研究表明，肉雞飼養(yǎng)環(huán)境溫度達(dá)到32 ℃時即可發(fā)生顯著的熱應(yīng)激反應(yīng)[1]。肉雞為滿足適應(yīng)高溫環(huán)境的需要，機體主動改變體內(nèi)多種物質(zhì)的代謝，以維持機體高溫環(huán)境下的熱平衡。熱應(yīng)激危害的程度與熱應(yīng)激引起機體營養(yǎng)物質(zhì)吸收、代謝改變密切相關(guān)[2]。國內(nèi)外研究者研究肉雞發(fā)生熱應(yīng)激時血清部分生化指標(biāo)的變化，初步證實了熱應(yīng)激發(fā)生時機體體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、代謝發(fā)生了顯著的變化[3- 4]。但這些數(shù)據(jù)無法從整體上系統(tǒng)全面的揭示機體重要營養(yǎng)物質(zhì)吸收、代謝狀況，對發(fā)生熱應(yīng)激時的差異性代謝標(biāo)志物以及代謝通路改變的情況仍無法得知，阻礙了從調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)吸收、代謝的角度來緩解熱應(yīng)激危害的思路。代謝組學(xué)研究能借助高通量分析技術(shù)更直接、準(zhǔn)確和系統(tǒng)地反映機體多種生命存續(xù)狀態(tài)下機體體內(nèi)代謝物的總和。利用代謝組學(xué)技術(shù)鑒定疾病發(fā)生過程中的特異性生物標(biāo)志物，可為疾病的早期診斷和提出針對性的治療措施提供依據(jù)[5-6]。檢測肉雞熱應(yīng)激時血清全部小分子物質(zhì)的組成輪廓有助于進一步揭示熱應(yīng)激引起肉雞危害的機制，但尚缺乏采用代謝組學(xué)方法分析肉雞熱應(yīng)激時血清全部代謝物的變化的研究。因此，本研究擬采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)技術(shù)，結(jié)合模式識別方法研究急性熱應(yīng)激時肉雞血清代謝組學(xué)變化，鑒定熱應(yīng)激發(fā)生時肉雞差異代謝物及代謝通路的變化，進一步闡明肉雞熱應(yīng)激發(fā)生機制，為早期診斷和防治熱應(yīng)激提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

雞舍使用前1周按照清潔消毒程序進行處理，分別用電子加熱器和加濕器進行溫控和濕控。試驗開始時，購進的愛拔益加(AA)商品肉雞按照飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)適應(yīng)性飼養(yǎng)至28日齡，選擇60只健康A(chǔ)A肉雞，隨機分為標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)組(對照組)和熱環(huán)境飼養(yǎng)組(熱應(yīng)激組)2組，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)6只雞，于同一籠飼養(yǎng)。繼續(xù)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d至肉雞35日齡開始正式試驗。對照組肉雞飼養(yǎng)舍內(nèi)繼續(xù)按照飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定的溫度飼養(yǎng)，熱應(yīng)激組飼養(yǎng)舍內(nèi)溫度調(diào)至(32±1) ℃，均持續(xù)12 h。飼養(yǎng)舍內(nèi)相對濕度均控制在(60±5)%。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kilogram of the diet: Mn 66 mg，Zn 44 mg，Cu 9 mg，F(xiàn)e 50 mg，I 0.4 mg，VA 7 000 IU，VD3875 IU，VE 20 mg，VK31 mg，VB12 mg，VB24.5 mg，D-泛酸鈣D-calcium pantothenate 12 mg，煙酸 nicotinic acid 50 mg，VB62.5 mg，VB120.6 mg。
2)營養(yǎng)水平為計算值。Nutrient levels were calculated values.

1.2 樣品制備

試驗開始12 h后，分別從每重復(fù)(籠)肉雞中隨機抽取2只雞，每組共抽取10只雞用于試驗，單側(cè)翅下靜脈一次性采集非抗凝血2 mL。血液置于4 ℃冰箱12 h，再置于37 ℃水浴鍋溫育20 min，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集血清，待測。

1.3 樣本前處理

血清和L-2-氯-苯丙氨酸(0.3 mg/mL)按照1∶5比例放入離心管漩渦10 s充分混勻。添加按照2∶1體積比配制的甲醇和乙腈溶液150 μL析出蛋白質(zhì)，置于-20 ℃低溫環(huán)境靜置10 min；借助超聲波作用完成提取后再次于-20 ℃下冷卻靜置10 min，15 000 r/min低溫離心10 min，取150 μL上清揮干后加入80 μL 15 mg/mL甲氧胺鹽酸吡啶溶液完成肟化反應(yīng)；加入80 μL含1%三甲基氯硅烷(TMCS)的N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)衍生試劑和20 μL的正己烷，于70 ℃反應(yīng)60 min。采用GC-MS儀對取出后放置于室溫條件下30 min的樣品進行代謝組學(xué)分析。

1.4 GC-MS分析

氣相色譜飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890A-5975C，Agilent公司，美國)用于本次試驗數(shù)據(jù)采集。制備好的樣品采用無分流模式注入GC-MS系統(tǒng)，經(jīng)DB-5MS毛細(xì)管柱分離后進行質(zhì)譜檢測。以流速1.0 mL/min高純氦氣為載氣。升溫程序為50～125 ℃，15 ℃/min；125～210 ℃，5 ℃/min；210～270 ℃，10 ℃/min；270～305 ℃，20 ℃/min；305 ℃維持5 min。進樣口溫度、電子轟擊電離源溫度、電壓分別設(shè)定為260、230 ℃和70 V。質(zhì)量掃描范圍(m/z)50～600，5 min后以20譜/s開始采集信號。

1.5 質(zhì)控樣本

試驗以2組AA肉雞血清樣品提取物充分混合制備質(zhì)控樣本。采用相同的方法處理和檢測制備好的質(zhì)控樣本。儀器分析操作過程中，每5個分析樣本中插入1個質(zhì)控樣本，以驗證本次試驗分析過程的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

GC-MS的原始數(shù)據(jù)經(jīng)ChromaTOF軟件(v 4.34，LECO公司，美國)進行預(yù)處理，導(dǎo)出包括樣品信息、保留時間-質(zhì)核比和質(zhì)譜響應(yīng)強度的三維數(shù)據(jù)矩陣CSV格式的文件。去除內(nèi)標(biāo)峰以及假陽性峰(包括噪音、柱流失和衍生物化試劑峰)，并進行去冗余和峰合并，分析樣本得到144個代謝物。樣本質(zhì)譜峰的響應(yīng)強度歸一化后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P+14.0軟件包，采用主成分分析法(PCA)和偏最小二乘法(PLS-DA)分析各樣本之間的總體分布、分析過程的穩(wěn)定性和各組間代謝輪廓的總體差異，鑒定組間差異代謝物。PLS-DA分析中，變量權(quán)重值(variable important in projection，VIP)大于1的變量被認(rèn)為是差異變量。通過7次循環(huán)交互驗證分析法以及200次響應(yīng)排序檢驗分析法防止試驗分析模型過擬合。

1.7 代謝物的鑒定

結(jié)合PLS-DA多維分析和t檢驗的單維分析方法篩選對照組與熱應(yīng)激組2組組間差異代謝物(VIP>1，P<0.05)。差異代謝物鑒定時，GC-MS工作站軟件自動把本試驗中檢測到的每種物質(zhì)的特征離子片段譜的質(zhì)荷比和豐度與NIST數(shù)據(jù)庫、Feihn代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)代謝物質(zhì)進行比對，其標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)選擇標(biāo)準(zhǔn)要求匹配度超過70%。

1.8 代謝通路富集分析

使用MBRole數(shù)據(jù)庫(http://csbg.cnb.csic.es/mbrole/)的ID轉(zhuǎn)換功能，獲取差異代謝物的KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)的物質(zhì)ID；結(jié)合2個數(shù)據(jù)庫的通路分析和通路富集功能，鑒別出對照組與熱應(yīng)激組2組肉雞血清中表現(xiàn)出來的顯著差異代謝通路；下載數(shù)據(jù)庫生成的代謝通路圖和肉雞熱應(yīng)激時代謝通路富集分析柱狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清樣品的GC-MS圖譜

圖1顯示了對照組和熱應(yīng)激組2組肉雞具有代表性的血清樣品的GC-MS檢測總離子流圖。圖中顯示本試驗過程中儀器收集血清代謝物質(zhì)的信號較強，生成的峰保留時間和容量均能達(dá)到試驗要求。將血清檢測質(zhì)譜圖與NIST數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對比，其匹配程度超過70%的代謝物共144種。結(jié)合多元統(tǒng)計和單維統(tǒng)計的方法分析熱應(yīng)激組與對照組2組間肉雞血清代謝物差異，描繪代謝組學(xué)特征。

圖1 GC-MS檢測獲得的對照組(A)和熱應(yīng)激組(B)總離子流圖Fig.1 A total ion chromatograms (TICs) of control group (A) and heat-stressed group (B) by GC-MS analysis

2.2 多元統(tǒng)計分析

2.2.1 PCA分析

2.2.2 PLS-DA分析

圖2 血清樣品GC-MS的PCA得分圖Fig.2 PCA score scatter plots of serum samples

圖3 血清樣品GC-MS的PLS-DA得分圖Fig.3 PLS-DA score scatter plots of serum samples

采用200次響應(yīng)排序的方法對模型的穩(wěn)健性進行考察，結(jié)果見圖4，其中R2=0.771>0.5，Q2=-0.314<0，說明此模型是穩(wěn)定可靠的。

圖4 使用200次響應(yīng)法對PLS-DA進行驗證的點圖Fig.4 Validation plots of PLS-DA with 200 permutation

2.3 差異代謝物鑒定

通過PLS-DA分析后，并根據(jù)VIP>1及t檢驗的P<0.05的相對變量標(biāo)準(zhǔn)分析結(jié)果，將代謝物的峰面積進行歸一化處理，經(jīng)過相對定量，篩選出30種差異代謝物(VIP>1，P<0.05)。其中延胡索酸、3-羥丁酸、丙氨酸等14種代謝物含量上調(diào)[差異倍數(shù)(FC)>1]，草酸、蘋果酸、二羥基丙酮等16種代謝物含量下調(diào)(FC<1)(表1)。

2.4 相關(guān)代謝通路富集分析

相關(guān)代謝通路富集分析結(jié)果見圖5。其中熱應(yīng)激對三羧酸循環(huán)代謝通路影響極顯著(P<0.01)，對丙酸鹽代謝通路影響次之(P<0.01)，此外，代謝通路富集分析還表明半乳糖代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、脂肪酸生物合成和不飽和脂肪酸生物合成代謝通路在急性熱應(yīng)激過程中也均發(fā)生顯著變化(P<0.05)。

3 討 論

熱應(yīng)激時機體在高環(huán)境溫度中為適應(yīng)外界環(huán)境會引起機體營養(yǎng)物質(zhì)吸收、代謝的改變。研究表明，熱應(yīng)激時機體部分組織的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)表達(dá)方面發(fā)生了顯著的變化[8-9]，但上述變化是如何最終引起機體代謝通路的變化及最終代謝物的變化不得而知。本研究利用GC-MS技術(shù)共鑒定出肉雞血清中144種代謝物，其中差異代謝物30種。通過代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)，三羧酸循環(huán)代謝通路發(fā)生了最顯著的變化。同時，丙酸鹽代謝、半乳糖代謝、脂肪酸生物合成等代謝通路也發(fā)生顯著改變。

3.1 能量代謝異常

肉雞發(fā)生熱應(yīng)激時，機體需要動員自身能量適應(yīng)外界環(huán)境。Hu等[10]研究表明，熱應(yīng)激可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝如改變細(xì)胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性發(fā)揮抗熱應(yīng)激作用。此外，熱應(yīng)激時其線粒體功能受到影響，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可抑制三羧酸循環(huán)過程中酶以及呼吸鏈復(fù)合酶的活性[11- 12]。本試驗通過代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)，三羧酸循環(huán)代謝通路發(fā)生了最顯著的變化。這提示熱應(yīng)激時機體三羧酸循環(huán)代謝過程中一些酶的活性可能發(fā)生顯著改變，從而導(dǎo)致該循環(huán)的一些代謝中間產(chǎn)物如延胡索酸無法正常進入循環(huán)參與代謝引起體內(nèi)該類物質(zhì)含量發(fā)生顯著變化。同時，血清中蘋果酸含量顯著降低，提示熱應(yīng)激發(fā)生時，其對三羧酸循環(huán)中由延胡索酸生成蘋果酸的步驟影響更為顯著。因此，可通過在飼糧中添加三羧酸循環(huán)的中間代謝物質(zhì)改善三羧酸循環(huán)效率，提高肉雞抗熱應(yīng)激的能力。

表2 對照組和熱應(yīng)激組差異代謝物鑒定Table 2 Identification of significantly different metabolites of control group and heat-stressed group

差異倍數(shù)>1，代表對照組該代謝物含量高于熱應(yīng)激組。P值由t檢驗獲得。
FC values greater than 1 mean that metabolite in control group was more than that in heat-stressed group.P-values were obtained byt-test.

熱應(yīng)激導(dǎo)致機體能量消耗增多，代謝速率加快，并下調(diào)果糖和甘露糖代謝[13-14]。本試驗研究表明，熱應(yīng)激時肉雞血清中糖代謝通路相關(guān)代謝物，如蔗糖、赤藻糖醇、β-甘露糖等含量顯著降低，表明熱應(yīng)激導(dǎo)致機體能量代謝異常，機體需加速分解糖類從而提供更多能量，以對抗應(yīng)激狀態(tài)。D-核糖是5-磷酸核糖和其他含有該單糖代謝物的前體，而5-磷酸核糖為合成RNA和DNA的原料。肉雞熱應(yīng)激時血清中D-核糖的含量顯著升高。因此推測熱應(yīng)激過程中DNA合成的減少可能與D-核糖含量無關(guān)，而與由D-核糖合成DNA過程失去控制有關(guān)[15]。此外，D-核糖參與機體腺苷酸如ATP合成與再生，進而維持心臟和骨骼肌的能量平衡。這與Gu等[16]報道不一致，可能與熱應(yīng)激維持的時間長短有關(guān)。此外，肌肉中代謝肌酸可增加肌糖原含量，從而提高熱應(yīng)激肉雞的散熱能力[14]。KEGG路徑富集后進一步分析表明，三羧酸循環(huán)發(fā)生了顯著改變，且乙醛酸和二羧酸代謝在熱應(yīng)激中也表現(xiàn)出異常。這與乙醛酸代謝通路產(chǎn)生的檸檬酸鹽和琥珀酸鹽，在生物氧化呼吸鏈反應(yīng)中充當(dāng)催化劑，二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白又可將檸檬酸、琥珀酸等物質(zhì)轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)參與能量的合成，進而調(diào)控能量代謝有關(guān)[17]。

1：三羧酸循環(huán)；2：丙酸鹽代謝；3：半乳糖代謝；4：乙醛酸和二羧酸代謝；5：脂肪酸生物合成；6：不飽和脂肪酸生物合成；7：精氨酸和脯氨酸代謝。
1: TCA cycle; 2: propanoate metabolism; 3: galactose metabolism; 4: glyoxylate and dicarboxylate metabolism; 5: fatty acid biosynthesis; 6: biosynthesis of unsaturated fatty acids; 7: arginine and proline metabolism.
圖5代謝通路富集分析
Fig.5 Metabolic pathway enrichment analysis

3.2 脂質(zhì)代謝異常

高溫環(huán)境致使肉雞基礎(chǔ)代謝率發(fā)生顯著變化，腹脂作為額外能量貯存形式沉積增多[18-19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激肉雞血清中羥丁酸、油酸、棕櫚油酸等多種脂質(zhì)代謝的相關(guān)指標(biāo)有顯著差異，說明肉雞熱應(yīng)激發(fā)生時脂質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂，這與Xiong等[20]的研究結(jié)果一致。此外，肉雞熱應(yīng)激時采食量下降導(dǎo)致能量缺乏，進而引起機體動員周圍組織脂肪供能。此時如生成的脂肪酸進入肝臟經(jīng)β-氧化生成大量酮體，不能被機體肝外組織充分利用，進入血液循環(huán)后引起高酮血癥[21]。本研究結(jié)果表明，熱應(yīng)激肉雞血清中羥丁酸的含量顯著升高，說明肉雞熱應(yīng)激時由于脂肪大量動員供能，大量的脂肪酸進入體內(nèi)，肝外組織利用酮體的能力低于肝中合成酮體量，導(dǎo)致酮體類物質(zhì)顯著增加[22]。

機體中油酸、棕櫚油酸、花生四烯酸等是動物體內(nèi)不飽和脂肪酸存在的重要形式。油酸可提高動物機體能量代謝效率，通過調(diào)節(jié)動物體內(nèi)脂類物質(zhì)代謝相關(guān)酶的活性發(fā)揮脂類分解和沉積的作用[23- 24]。棕櫚油酸在體內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和脂質(zhì)特別三酰甘油的合成，同時還可調(diào)節(jié)脂酶的活性[25]。花生四烯酸除作為磷脂結(jié)合的結(jié)構(gòu)直接調(diào)節(jié)脂類代謝外，還可以通過白細(xì)胞三烯、血栓烷素A2、前列腺素E2的間接途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝作用[26]。試驗表明肉雞熱應(yīng)激時血清多種不飽和脂肪酸含量顯著增加，可能是機體為應(yīng)對熱應(yīng)激時能量代謝的需要而出現(xiàn)的短暫的上升，也是脂肪定向沉積的搬運形式。上述結(jié)果提示，飼糧中通過添加具有促進脂肪代謝的不飽和酸有利于減少熱應(yīng)激時脂肪代謝紊亂的發(fā)生。

綜合上述物質(zhì)含量的變化規(guī)律，經(jīng)KEGG路徑分析表明，熱應(yīng)激肉雞血清中飽和和不飽和脂肪酸合成通路均發(fā)生了顯著變化。因此，揭示脂質(zhì)代謝通路特別是飽和和不飽和脂肪合成途徑改變機制，是急性肉雞熱應(yīng)激代謝機制的又一重要研究課題。

3.3 氨基酸代謝異常

碳架結(jié)構(gòu)和氨是氨基酸在體內(nèi)分解的最終形式。碳架結(jié)構(gòu)可繼續(xù)參與機體糖、脂代謝，氨以含氮代謝廢物的形式排出體外。本研究結(jié)果顯示，熱應(yīng)激肉雞血清中丙氨酸的含量顯著增加，推測可能是丙氨酸在體內(nèi)參與能量代謝有關(guān)。丙氨酸-葡萄糖循環(huán)是其發(fā)揮能量代謝的重要途徑[27]。肉雞發(fā)生熱應(yīng)激時，機體需要調(diào)整體內(nèi)能量代謝過程來適應(yīng)高溫環(huán)境，作為能量的提供形式，葡萄糖的消耗伴隨大量丙酮酸的生成，為了維持能量持續(xù)供給，此時需要丙氨酸代謝通路的參與[28]。此外，機體內(nèi)精氨酸、脯氨酸可通過氨基酸轉(zhuǎn)化途徑生成谷氨酰胺，然后在丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶作用下，脫去氨基生成三羧酸循環(huán)途徑的重要中間物質(zhì)α-酮戊二酸提供能量。在這一過程中，通過脫氨基作用，丙氨酸迅速轉(zhuǎn)變?yōu)楸岽龠M機體內(nèi)三羧酸供能循環(huán)的進行[29]。血清中天冬氨酸含量在本試驗過程中呈現(xiàn)顯著下降的趨勢。熱應(yīng)激影響了機體的血液循環(huán)系統(tǒng)，機體通過消耗大量的天冬氨酸向心肌輸送鉀離子、鎂離子增強心肌收縮功能，降低氧耗，減輕熱應(yīng)激對心肌的危害。此外，肉雞熱應(yīng)激時需要消耗大量的葡萄糖供能對抗熱應(yīng)激發(fā)生的危害，此時，生糖氨基酸如天冬氨酸通過糖異生途徑生成葡萄糖，緩解機體代謝過程中葡萄糖含量不足的問題[30]。熱應(yīng)激時氨基酸代謝特征分析表明，飼糧中添加一些具有生糖或促進能量物質(zhì)吸收的氨基酸有助于熱應(yīng)激的防控。

另外，經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫查閱發(fā)現(xiàn)，除丙酸鹽代謝通路(KEGG數(shù)據(jù)庫ID號gga00640)發(fā)生顯著改變外，機體精氨酸、脯氨酸代謝也參與熱應(yīng)激反應(yīng)過程。肉雞熱應(yīng)激時機體蛋白質(zhì)分解代謝增強，為避免此時產(chǎn)生的氨對機體造成危害，需要及時排出體外，而精氨酸是體內(nèi)氨排出過程的重要中間代謝物。脯氨酸是機體內(nèi)重要滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)，其代謝通路變化可能與機體熱應(yīng)激時脫水引起的機體內(nèi)環(huán)境滲透壓的改變有密切關(guān)系。此外，精氨酸和脯氨酸合成和代謝與腸道功能密切相關(guān)，其代謝通路異?？赡芘c腸道在肉雞急性熱應(yīng)激過程中有重要影響有關(guān)。今后通過加強精氨酸和脯氨酸在熱應(yīng)激肉雞腸道功能的影響，有助于為揭示急性肉雞熱應(yīng)激發(fā)生機理和防治肉雞急性熱應(yīng)激提供新線索。

4 結(jié) 論

① 本試驗應(yīng)用GC-MS技術(shù)的代謝組學(xué)方法研究了肉雞熱應(yīng)激時血清中小分子代謝物的改變，共有30種差異代謝物被鑒別出，其中14種物質(zhì)上調(diào)，16種物質(zhì)下調(diào)，說明熱應(yīng)激時肉雞為適應(yīng)高溫環(huán)境其營養(yǎng)物質(zhì)代謝發(fā)生了顯著的變化。

② 通過代謝通路富集研究發(fā)現(xiàn)，三羧酸循環(huán)、脂肪酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝通路等發(fā)生顯著改變。