不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉生長性能、血清生化指標及肝胰臟糖代謝酶活性的影響

崔 培 孫金輝 尹 帥 程鎮(zhèn)燕 喬秀亭 周歧存

(1.寧波大學海洋學院魚類營養(yǎng)研究室，寧波 315211；2.天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

糖(碳水化合物)是動物飼料中最廉價的能源物質(zhì)，若能利用價格低廉的糖作為能源物質(zhì)替代部分蛋白質(zhì)，起到“蛋白質(zhì)節(jié)約作用(protein-sparing effects)”，則不僅可以降低飼料蛋白質(zhì)含量和成本，同時還可以保護漁業(yè)資源，減少養(yǎng)殖過程中氮排泄對水體的污染[1]。然而，與陸生動物相比，魚類對糖的利用能力差[2-3]。飼料中糖水平過高會導致魚類生長遲緩，飼料利用率降低，抗病力減弱，甚至是死亡[4-5]。

三價鉻離子(Cr3+)作為動物必需的微量元素形式，在機體糖、蛋白質(zhì)、脂肪代謝中起重要作用[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，Cr3+通過增強胰島素(insulin,INS)的作用，進而提高機體葡萄糖耐量[8-9]。已有研究證實，Cr3+能有效改善草魚(Ctenopharyngodonidellus)[10]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[11]、大黃魚(Larmichthyscrocea)[12]以及羅非魚(Oreochromisniloticus×Oreochromisaureus)[13]的生長性能，增強莫桑比克羅非魚[14]、虹鱒[15]的免疫機能，還可提高條紋鱸(Moronesaxatilis)[16]的糖利用能力。此外，Cr3+還能有效降低血漿中皮質(zhì)醇(cortisol，COR)的含量，改善機體應激狀態(tài)[17-18]。

目前，已有一些學者針對Cr3+在鯉生長、飼料利用方面的影響做了一些研究[19-20]，但這些研究所使用的鉻源多是無機鉻，而研究證實，與無機鉻相比，有機鉻具有更高的吸收率、生物活性及穩(wěn)定性[21]，如畜禽動物中應用最為廣泛的鉻源——吡啶羧酸鉻(CrPic)以及氨基酸螯合鉻——蛋氨酸鉻(CrMet)，這2種鉻源分別是吡啶甲酸和蛋氨酸與Cr3+的螯合物，能夠有效緩解礦物元素之間的拮抗競爭作用，有利于鉻的吸收。關于有機鉻作為鯉飼料添加劑的安全劑量及對其機體生理的作用的報道較少。本文以鯉利用較差的葡萄糖為糖源，比較3種不同形式的鉻——無機鉻、有機酸鉻、氨基酸鉻對喂食高葡萄糖飼料鯉生長性能、血清生化指標及肝胰臟糖代謝酶活性的影響，為鉻在鯉配合飼料中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料配制

以酪蛋白為蛋白質(zhì)源、大豆油為脂肪源、葡萄糖為糖源配制4種純化飼料，分別為不添加鉻的基礎飼料(對照組)及基礎飼料中分別添加Cr2O3、CrPic和CrMet的試驗飼料，試驗飼料中鉻添加水平在2.60 mg/kg(以Cr3+計)左右。其中，CrPic購自國藥集團化學試劑有限公司，有效含量98%，Cr含量為12.4%。CrMet購自湖北拓楚慷元醫(yī)藥化工有限公司有效含量為99%，Cr含量為80%。所有固體飼料原料均過80目篩，原料逐級放大混勻后，用雙螺桿制粒機(華南理工大學機械工程研究所制造)制成顆粒飼料，每種飼料2種規(guī)格(直徑為1.5和3.2 mm)，在烘箱(DK400，日本Yamato)中40 ℃烘干2 h，取出后自然風干，保存于-20 ℃冰箱中。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis)

續(xù)表1項目 Items飼料 Diets基礎飼料 Basal diet三氧化二鉻 Cr2O3吡啶羧酸鉻 CrPic蛋氨酸鉻 CrMet粗灰分 Ash/%3.213.482.972.48干物質(zhì) DM/%91.7491.7491.7791.13鉻 Cr/(mg/kg DM)0.682.832.592.68

預混料為每千克飼料提供 The premix provided the following for per kg of diets：VA 6 000 IU，VD32 000 IU，VE 60 mg，VK310 mg，VB19 mg，VB29 mg，VB67.5 mg，VB120.03 mg，VC 90 mg，D-生物素D-biotin 0.15 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 30 mg，葉酸 folic acid 3 mg，煙酰胺 nicotinamide 45 mg，肌醇 inositol 80 mg，F(xiàn)e 140 mg，Cu 3.5 mg，Zn 40 mg，Mg 100 mg，Co 0.25 mg，I 0.5 mg，Se 0.3 mg，Mn 15 mg，乙氧基喹啉 ethoxyquin 5 mg。

1.2 試驗魚及飼養(yǎng)管理

試驗魚由天津市晨輝飼料有限公司養(yǎng)殖基地提供，運送到晨輝飼料有限公司養(yǎng)殖實驗室后，暫養(yǎng)2周，期間投喂基礎飼料(不添加Cr3+)，待試驗魚適應實驗室環(huán)境后，選取健康、規(guī)格基本一致的試驗魚[初始體重為(40.95±4.80) g]，隨機分配到12只800 L藍色圓形塑料水箱中，每組設3個重復，每個重復投放試驗魚60尾。養(yǎng)殖模式為靜水養(yǎng)殖。試驗用水為曝氣24 h以上的自來水，每天投喂2次(07:00、16:00)，日投喂量為體重的4%～6%。每2周調(diào)整1次投飼量。每天換水1次，同時吸底并收取糞便，換水量為總水量的1/3，飼養(yǎng)試驗期間水溫為15～25 ℃，pH 7.6～7.8，氨氮濃度≤0.05 mg/L，溶解氧濃度≥6.0 mg/L。養(yǎng)殖周期為60 d。

1.3 樣品采集

經(jīng)60 d飼養(yǎng)后，試驗魚禁食24 h，經(jīng)丁香酚(1∶10 000)麻醉后，稱重并記錄尾數(shù)。每只水槽隨機取6尾保存在-20 ℃冰箱中，用于體成分分析；另取10尾試驗魚，尾部采血，離心5 min(4 ℃，3 500 r/min)，取上清后保存，備用，用于檢測血清生化指標；采血后的試驗魚于冰盤上解剖取肝胰臟和肌肉組織，用于檢測糖代謝酶活性、糖原含量活性，所有樣品于-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.4 測定方法

試驗飼料和魚體常規(guī)營養(yǎng)成分的測定參照AOAC(1995)[22]進行：水分含量測定采用恒重恒壓干燥法(GB/T 5009.3—2010)；粗蛋白質(zhì)、粗脂肪與粗灰分含量分別采用杜馬斯燃燒法(GB/T 24318—2009，美國Thermo公司的Thermo Fisher scientific FLASH2000全自動蛋白質(zhì)測定儀)、索氏抽提法(GB/T 5009.6—2010，德國Gerhardt公司的Gerhardt SOXTHERM索氏抽提儀)、灼燒重量法(GB/T 5009.4—2010)進行測定。飼料中鉻含量采用原子吸收光譜法(石墨爐原子化法)測定。

肝胰臟、肌肉糖原含量的測定參考Hassid等[23]的方法，采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒。將肝胰臟或肌肉與強堿以1∶3(質(zhì)量體積比)混合，沸水浴20 min溶解形成溶液，分別稀釋為1%和5%的檢測液，然后將其與濃硫酸反應形成乙醛，最后加入蒽酮，然后染色劑染色，使用分光光度計在620 nm下測定吸光度值。

血清葡萄糖(glucose,GLU)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)含量及肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)活性由天津市金域醫(yī)學檢驗所檢驗，儀器為德國Roche公司的Roche C311全自動生化分析儀。血清INS、胰高血糖素(glycogen,GC)、胰島素受體(insulin receptor,ISR)、生長激素(growth hormone,GH)、COR含量均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒測定，其中INS、GC試劑盒購自美國Assay Designs公司，ISR、GH試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

肝胰臟已糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、琥珀酸脫氫酶(succinic acid dehydrogenase,SDH)活性采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，肝胰臟磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,6-PFK1)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose 6-phosphatase dehydrogenase,G6PDH)、糖原合成酶(glycogen synthase,GS)以及脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FAS)活性采用雙抗體夾心法測定，采用ELISA試劑盒(美國Assay Designs)測定。測定方法嚴格按照試劑盒說明書進行，其中，所有ELISA試劑盒測定方法為在微孔中加入樣品，然后加入相應的抗體，37 ℃溫浴60 min，洗板5次后加入相應顯色劑反應，最后加入終止液終止反應，測定各微孔吸光度值，計算活性。

1.5 計算公式

增重率(WGR,%)=[(Wt-W0)/W0]×100；特定生長率(SGR,%/d)=[(lnWt-lnW0)/t]×100；飼料效率(FE)=(Wf+Wd-W0)/C；蛋白質(zhì)效率(PER)=(Wt-W0)/Cp；成活率(SR,%)=成活尾數(shù)/總尾數(shù)×100。

式中：W0為試驗魚初始體重；Wt為試驗魚終末體重；t為試驗天數(shù)；C為攝餌采食量；Wf為試驗魚終末總重；Wd為死亡試驗魚總重；Wi為試驗魚初始總重；Cp為蛋白質(zhì)攝入量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若差異顯著(P<0.05)，則用Tukey’s法進行多重比較。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結(jié) 果

2.1 不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉生長性能的影響

不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉生長性能的影響見表2。由表可知，各組試驗魚的SR在91.67%～95.00%，組間無顯著差異(P>0.05)。鉻源添加組WGR、SGR顯著高于對照組(P<0.05)，最高值均出現(xiàn)在CrMet組，但與CrPic組相比，差異均不顯著(P>0.05)。與對照組相比，CrPic和CrMet組FE和PER顯著提高(P<0.05)，Cr2O3組無顯著變化(P>0.05)。

表2 不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉生長性能的影響Table 2 Effects of different chromium sources on growth performance of common carp fed high glucose diets

同行數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。
Values in the same row with different letter superscripts mean significant differences (P<0.05). The same as below.

2.2 不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉常規(guī)營養(yǎng)成分的影響

不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉常規(guī)營養(yǎng)成分的影響見表3。由表可知，CrPic、CrMet組全魚脂肪含量顯著高于對照組和Cr2O3組(P<0.05)。CrMet組全魚肝糖原含量顯著高于對照組和Cr2O3組(P<0.05)。鉻源添加組全魚肌糖原含量顯著提高(P<0.05)。各組全魚水分、蛋白質(zhì)、灰分無顯著差異(P>0.05)。

2.3 不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉血清生化指標的影響

不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉血清生化指標的影響見表4。由表可知，與對照組相比，CrMet組血清TG和TC含量顯著降低(P<0.05)，Cr2O3和CrPic組無顯著變化(P>0.05)。各組血清HDL和LDL含量無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，CrMet組血清INS、ISR含量顯著提高(P<0.05)，而Cr2O3、CrPic組無顯著變化(P>0.05)。與對照組相比，鉻源添加組鯉血清GH含量和LDH活性均顯著提高(P<0.05)，血清葡萄糖及COR含量顯著降低(P<0.05)，且鉻源添加組間均無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，Cr2O3、CrMet組血清CK活性均顯著提高(P<0.05)，而CrPic組無顯著變化(P>0.05)。各組血清GC含量無顯著差異(P>0.05)。

表3 不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉全魚常規(guī)營養(yǎng)成分的影響Table 3 Effects of different chromium sources on common nutritional components of whole body of common carp fed high glucose diets

表4 不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉血清生化指標的影響Table 4 Effects of different chromium sources on serum biochemical indices of common carp fed high glucose diets

2.4 不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉肝胰臟糖代謝酶活性的影響

不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉肝胰臟糖代謝酶活性的影響見表5。由表可知，與對照組相比，鉻源添加組肝胰臟HK、PK活性均顯著提高(P<0.05)。CrPic組肝胰臟SDH活性最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。與對照組相比，CrPic、CrMet組肝胰臟PEPCK活性顯著降低(P<0.05)，肝胰臟FAS活性顯著提高(P<0.05)。與對照組相比，鉻源添加組肝胰臟GS活性顯著提高(P<0.05)。各組肝胰臟6-PFK1和G6PDH活性無顯著差異(P>0.05)。

表5 不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉肝胰臟糖代謝酶活性的影響Table 5 Effects of different chromium sources on hepatopancreas glycometabolism enzyme activities of common carp fed high glucose diets

3 討 論

3.1 不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉生長性能的影響

本試驗結(jié)果顯示，添加3種鉻源均能提高鯉的生長性能，這與Ahmed等[19]用添加氯化鉻(CrCl3)的飼料投喂鯉、潘慶等[24]用添加CrPic和煙酸鉻(CrNic)的飼料投喂奧尼羅非魚、Wang等[12]用添加CrNic的飼料投喂大黃魚以及在以葡萄糖為糖源的飼料中添加Cr2O3、CrCl3投喂羅非魚[25-28]的研究結(jié)果相一致。而在飼料中添加CrPic對虹鱒和奧尼羅非魚的生長性能沒有顯著影響[11,28-29]，類似的結(jié)果也出現(xiàn)在用添加酵母鉻的飼料投喂金頭鯛(Sparusaurata)[30]和虹鱒[31]的試驗中，其原因可能與試驗魚的種類、鉻的添加形式及水平、飼養(yǎng)環(huán)境條件、試驗設計等因素有關。同時，本試驗結(jié)果顯示添加有機鉻后對鯉生長的促進效果的影響要優(yōu)于無機鉻。一般認為，在生理環(huán)境下有機鉻比無機鉻具有更高的生物活性和穩(wěn)定性，而且機體對有機鉻的吸收率要遠高于無機鉻，研究發(fā)現(xiàn)無機鉻的吸收率僅為1%～3%[32]，而有機鉻的吸收率為10%～25%[33]。因而，本試驗結(jié)果可能因為添加有機鉻組的試驗魚吸收更多的鉻，更有效地促進了鯉的生長，這與劉太亮[34]對草魚的研究結(jié)果相類似。

3.2 不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉常規(guī)營養(yǎng)成分的影響

本試驗結(jié)果顯示，不同鉻源對試驗魚體水分、蛋白質(zhì)、灰分含量均無顯著影響，而添加有機鉻能顯著提高魚體脂肪含量，與已報道的羅非魚的研究結(jié)果一致[28,35]。研究發(fā)現(xiàn)，Cr3+能夠通過協(xié)同INS發(fā)揮生物學功能，提高相關代謝酶的活性，從而參與機體營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，進而改變營養(yǎng)物質(zhì)的沉積方向[36-37]。本試驗中有機鉻組試驗魚體脂肪含量的升高可能是添加有機鉻后提高了肝胰臟FAS的活性，從而對全魚脂肪含量產(chǎn)生影響，在豬飼料中添加鉻后也發(fā)現(xiàn)了相類似的情況[38-39]。

葡萄糖在GS的催化作用下，經(jīng)糖異生作用合成糖原貯存在機體各組織中，其中肝臟和肌肉是最主要的貯存場所[40]。Steele等[41]報道了CrCl3能有效提高土耳其火雞肝臟GS活性，促進機體糖異生作用，從而提高了肝糖原含量。本試驗結(jié)果與上述報道相類似，在飼料中添加3種鉻源均能顯著提高試驗魚肌糖原含量，肝糖原含量也有所增加，添加CrMet的試驗魚肝糖原含量顯著高于對照組。同時，對肝胰臟GS活性的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種形式鉻均顯著提高該酶的活性，表明3種鉻源對于促進肝胰臟和肌糖原合成作用具有顯著效果。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在Campbell等[42]對小鼠的報道中。

3.3 不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉血清生化指標的影響

鉻元素對動物機體脂類代謝的主要作用是維持血液中正常膽固醇水平。研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加CrPic可有效降低羅非魚血清TC含量[43]。本試驗結(jié)果與上述結(jié)果相類似，添加CrMet能有效降低試驗魚血清TG、TC含量，改善試驗魚血脂水平。而劉太亮[34]在草魚飼料中添加不同形式鉻后未發(fā)現(xiàn)對其血清TC含量產(chǎn)生影響。其原因可能是研究試驗動物種類、飼料營養(yǎng)成分、養(yǎng)殖條件有所不同。

研究證實，Cr3+能夠有效加快血液中葡萄糖的消失速度，縮短葡萄糖的半衰期，從而降低血清中葡萄糖含量[44]。對羅非魚的研究發(fā)現(xiàn)，添加不同鉻源(Cr2O3、CrCl3、CrPic、CrNic)均延遲了血清葡萄糖含量高峰的到來，降低了血清葡萄糖含量，提高了羅非魚對飼料中糖的利用[24,25,28,43]。劉太亮[34]在草魚飼料中分別添加了CrPic和CrNic，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2種鉻源均能有效降低草魚血清葡萄糖含量，提高肝糖原含量，證實CrPic和CrNic能夠提高草魚對飼料中糖的利用率。本試驗結(jié)果顯示，CrMet能顯著降低試驗魚血清葡萄糖含量，與上述結(jié)果相類似，而Cr2O3和CrPic沒有對血清葡萄糖含量產(chǎn)生影響。這說明以CrMet形式存在的鉻源可能促進了鉻的吸收，增加了INS的敏感性，增強了魚體糖代謝，從而降低了血清葡萄糖含量。血清中LDH活性在添加CrMet后顯著升高也表明了魚體糖代謝的增強。

Liu等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，添加適量CrPic能顯著提高草魚血清INS含量。本試驗與上述結(jié)果相類似，添加CrMet后試驗魚血清INS含量顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)，Cr3+通過增加ISR含量或促進INS和細胞膜上的ISR結(jié)合，從而提高細胞對葡萄糖的敏感性[9,33]，本試驗中CrMet組血清ISR含量顯著升高這一結(jié)果也證實了此觀點。同時，血清COR含量在添加3種鉻源后均顯著降低，這反映出典型的INS(合成代謝)與COR(分解代謝)間的代謝關系，即機體INS含量與COR含量呈反向相關，而不同形式鉻的添加沒有改變這種相關性。添加鉻后試驗魚血清INS含量升高，證明了鉻作為INS的輔因子來協(xié)同INS作用的生理學作用。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在Sahin等[45]的研究中，該研究得出CrPic能夠提高低溫條件下產(chǎn)蛋雞血漿INS含量，并顯著降低血漿COR含量。

3.4 不同鉻源對喂食高葡萄糖飼料鯉肝胰臟糖代謝酶活性的影響

Cr3+通過調(diào)節(jié)葡萄糖代謝酶影響機體葡萄糖代謝。HK是肝胰臟利用葡萄糖的第1限速酶。在本試驗中，添加3種鉻源的肝胰臟HK活性均顯著高于對照組，這可能是由于Cr3+的添加直接刺激組織糖酵解途徑，加速葡萄糖氧化，從而使得葡萄糖含量降低，ATP生成增加。然而，Ahmed等[19]報道在飼料中添加CrCl3對鯉肝胰臟HK活性沒有顯著影響。這種差異可能是由于鉻的不同添加形式以及水平造成的。除了HK，6-PFK1和PK也是控制糖酵解途徑速率的關鍵酶。PK催化的反應是葡萄糖生成丙酮酸的最后一步反應，即催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸。本試驗結(jié)果顯示，喂食添加3種鉻源飼料的鯉肝胰臟中PK的活性均顯著上升，說明3種鉻源能夠促進糖酵解途徑。

PEPCK催化糖異生作用的第一步，將草酰乙酸鹽轉(zhuǎn)變成磷酸烯醇式丙酮酸鹽[46]。研究發(fā)現(xiàn)，Cr3+能夠通過在動物體內(nèi)形成核酸衍生物從而直接抑制PEPCK活性[47]。Gardner等[48]證實了INS自身也可抑制PEPCK活性，這種抑制是通過抑制其PEPCK基因的表達造成的，而鉻具有協(xié)調(diào)INS作用的生物學作用，因此，鉻的補充能夠通過加強INS作用進一步間接抑制PEPCK活性。本試驗結(jié)果與上述研究相類似，添加CrPic和CrMet顯著抑制了鯉肝胰臟的PEPCK活性，PEPCK活性的減少可能導致糖異生作用減緩，從而減少內(nèi)源性葡萄糖的生成。

G6PDH是糖代謝的磷酸戊糖途徑的關鍵酶，它促使磷酸戊糖核酸合成、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的合成反應并維持細胞的氧化還原狀態(tài)[49]。本試驗中，添加3種鉻源未均對G6PDH活性產(chǎn)生顯著影響，這與Pan等[29]對羅非魚的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

在葡萄糖含量為35%的飼料中分別添加2.92 mg/kg Cr2O3、16.46 mg/kg CrPic、2.52 mg/kg CrMet對于鯉的生長、飼料利用以及糖利用能力均有促進效果，其中以CrMet效果最好，CrPic次之，而Cr2O3效果最差。