三疣梭子蟹抗菌肽Scygonadin基因的克隆與序列分析

任海波, 李燕波, 張肖榮, 金信飛, 唐迎迎

(1. 寧波海洋研究院， 寧波 315832； 2. 寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211；3. 寧波市鄞州區(qū)咸祥鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站， 寧波 315141 )

甲殼動物營養(yǎng)豐富，味道鮮美，已成為我國沿海地區(qū)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖對象。其中三疣梭子蟹是大宗養(yǎng)殖品種，具有很高的經(jīng)濟價值[1]。但長期以來，養(yǎng)殖病害頻發(fā)已成為制約蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸問題，也帶來了巨大的經(jīng)濟損失[2]。而傳統(tǒng)抗生素和化學(xué)藥物的防治、濫用不同程度地增強了微生物的耐藥性，影響了養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。因此，尋找傳統(tǒng)抗生素和化學(xué)藥物的綠色、安全替代物已成為當前首要解決的課題之一。

抗菌肽(AMPs，autimicrobial peptides)已證實是甲殼動物體系免疫的重要組成部分，是一類生物體中普遍存在的具有抗菌活性的小分子多肽。因其不易產(chǎn)生微生物耐藥性、無有害殘留等優(yōu)點，已被視為抗生素的有效替代品，通過向飼料中添加抗菌肽制劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，并取得了良好的效果[3]。近年來關(guān)于三疣梭子蟹抗菌肽的研究主要散見于各位學(xué)者的研究報告中，如抗脂多糖因子[4]、scygonadin 基因[5]、Crustin基因[6]、Pthastatin基因[7]等?？咕膕cygonadin屬于除對蝦抗菌肽Penaeidins、Crustins抗菌肽和抗脂多糖因子(ALPs)三類抗菌肽以外的具有抗菌功能的小肽[8]，首次從鋸緣青蟹(Scyllaserrata)的雄性生殖系統(tǒng)中分離獲得，是一種與生殖免疫相關(guān)的陰離子抗菌肽[5,9]。鋸緣青蟹屬梭子蟹科(Portunidae)，青蟹屬(Scylla)，喜穴居近岸淺海和河口處的泥沙底內(nèi)。而三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)屬于梭子蟹科(Portunidae)，梭子蟹屬 (Portunus)，一般在3～5 m深海底生活及繁殖，冬天移居到10～30 m的深海，其與鋸緣青蟹同科不同屬。目前三疣梭子蟹Scygonadin基因的研究尚未見報道。

本研究以三疣梭子蟹為材料，利用RT-PCR方法克隆獲得三疣梭子蟹ScygonadincDNA序列，并對其進行生物信息學(xué)分析，為三疣梭子蟹免疫防御功能和Scygonadin基因功能相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性三疣梭子蟹購自寧波鎮(zhèn)海水產(chǎn)品市場。RNA酶抑制劑、10×T4DNA Ligase Buffer、pMD18-T Vector、AMV反轉(zhuǎn)錄酶和DNATaq聚合酶購自TaKaRa公司；SMARTTMRACE cDNA Amplification試劑盒購自Clontech公司；膠DNA回收試劑盒(上海捷瑞)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取

稱取100 mg剝離的三疣梭子蟹射精管，按照Trizol(大連寶生物)說明進行總RNA提取，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.2.2 cDNA的合成

總RNA利用Oligo dT-adaptor 為引物反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA。cDNA置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 三疣梭子蟹Scygonadin基因核心序列的擴增

根據(jù)鋸緣青蟹(Scyllaserrata)和擬穴青蟹(ScyllaParamamosain)scygonadin cDNA序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物(F45和R456)(表1)，以第一鏈cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增體系為50 μL。擴增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s,30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.2.4 三疣梭子蟹Scygonadin基因3′RACE和5′RACE的擴增

本研究采用SMARTTMRACE cDNA Amplification試劑盒，具體操作按照說明書的方法進行。根據(jù)得到的核心序列，以三疣梭子蟹 cDNA為模板，以adaptor和F45為引物，利用RACE技術(shù)進行3′擴增，擴增體系50 μL。擴增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。根據(jù)上述獲得的Scygonadin 基因片段，設(shè)計兩個反義鏈引物R375和R281，以O(shè)ligo dT-adaptor、adaptor、R375和R281為引物，通過兩輪進行5′半巢氏PCR。兩輪PCR均在50 μL體系下進行反應(yīng)，反應(yīng)條件：第一輪95℃預(yù)變性5 min；58℃退火5 min，30個循環(huán)；72℃延伸40 min。94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸3 min；72℃再延伸10 min。第二輪95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，30個循環(huán)；58℃退火45 s，72℃延伸3 min；72℃再延伸10 min。以上擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 PCR引物序列

1.2.5 產(chǎn)物克隆與測序

PCR產(chǎn)物電泳后，將含有目的片段的瓊脂糖凝膠切下，用膠回收試劑盒進行回收純化，回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化，選取陽性克隆菌落進行測序。

1.2.6 序列分析

在NCBI上，利用在線ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)完成ORF的查找和核苷酸的翻譯，利用 SignalP 4.0 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽切割位點預(yù)測，利用ProtParam在線軟件(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)進行蛋白質(zhì)序列分子質(zhì)量、氨基酸組成和等電點等基本性質(zhì)分析。利用NCBI BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進行核苷酸與氨基酸序列同源性分析，利用ClustalW2在線軟件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進行多序列比對。

2 結(jié)果

2.1 Scygonadin基因的克隆

根據(jù)鋸緣青蟹ScygonadincDNA序列設(shè)計特異性引物(F45和R456)進行RT-PCT，經(jīng)測序該片段長度為400 bp。用引物adaptor和F45進行3′RACE，測序結(jié)果顯示該片段長度為500 bp，與預(yù)期擴增的基因片段一致。用引物Oligo dT-adaptor，adaptor，R375和R281兩對引物通過兩輪PCR進行5′RACE，測序結(jié)果顯示片段長度分別為400 bp(1st PCR)和300 bp(2nd PCR)。將測序得到的序列進行拼接，獲得長度為549 bp的ScygonadincDNA序列(不包括polyA)，序列見圖1。

利用ORF Finder軟件分析核苷酸序列，結(jié)果顯示該ScygonadincDNA序列包含56 bp的5′非編碼區(qū)、121 bp的3′非編碼區(qū)和372 bp的ORF(包括終止子TAA)。3′非編碼區(qū)包括保守的信號序列(AATAAA)和34個非腺苷酸序列和多聚腺苷酸序列。該Scygonadin基因ORF區(qū)共編碼123個氨基酸，利用 SignalP 4.0 Server預(yù)測，得到了一個有29個氨基酸組成的信號肽序列，信號肽的切割位點在Asn29和Lys30之間(圖2)。利用ProtParam在線軟件分析結(jié)果顯示，Scygonadin成熟肽含有94個氨基酸殘基，其中包括34個疏水性氨基酸，23個極性氨基酸，10個強堿性氨基酸，13個強酸性氨基酸。平均分子質(zhì)量為10 606.1 u，pI為5.74，帶有電荷-3，符合陰離子抗菌肽的要求。不穩(wěn)定指數(shù)為35.07，蛋白質(zhì)穩(wěn)定。

圖1 三疣梭子蟹Scygonadin全長cDNA核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

ATG和TAA分別表示起始密碼子和終止密碼子；AATAAA為poly A加尾信號

2.2 Scygonadin基因的序列比對分析

在NCBI上搜索到三疣梭子蟹Scygonadin序列的相似序列3條，分別為鋸緣青蟹Scygonadin(AAW57403)、鋸緣青蟹Scygonadin2 (ABI96981)和擬穴青蟹Scygonadin1(ACY78509)，這3條序列對應(yīng)的氨基酸序列與三疣梭子蟹Scygonadin氨基酸序列進行比對(圖3)， 其相似性分別為68.3%、60.6%和52.4%。根據(jù)先前實驗獲得的日本蟳Scygonadin基因核苷酸序列和氨基酸序列，同源性比對分別為74.0%和52.0%。

3 討論

三疣梭子蟹是我國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟蟹類，但近年來其養(yǎng)殖病害的日益嚴重，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失。迄今為止關(guān)于三疣梭子蟹免疫防御功能的研究極少，已報道基因的三疣梭子蟹免疫相關(guān)因子僅見酚氧化酶[10]、熱休克蛋白Hsp70[11]、C-type lectin like-domain(CTLD)-containing protein[12]等，抗菌肽研究尚不成熟。Scygonadin是從甲殼動物中分離并被鑒定，主要在雄性生殖系統(tǒng)中表達的第一個抗菌肽基因[13]，對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌具有選擇性的抗菌活性[14]。

圖2 利用 SignalP 4.0 Server軟件預(yù)測Scygonadin信號肽的切割位點結(jié)果

圖3 三疣梭子蟹Scygonadin，鋸緣青蟹Scygonadin, Scygonadin2和擬穴青蟹Scygonadin氨基酸序列比對

本論文根據(jù)已知種類的cDNA同源序列，設(shè)計特異性引物，通過RT-PCR、3′和5′RACE擴增，成功分離出三疣梭子蟹目的ScygonadincDNA序列。三疣梭子蟹Scygonadin氨基酸序列與NCBI上的鋸緣青蟹Scygonadin(AAW57403)、鋸緣青蟹Scygonadin 2(ABI96981)和擬穴青蟹Scygonadin(ACY78509)的氨基酸序列相似性分別為68.3%、60.6%和52.4%。根據(jù)先前實驗獲得的日本蟳Scygonadin基因核苷酸序列和氨基酸序列，同源性比對分別為74.0%和52.0%。而基于細胞色素C氧化酶I基因(COI基因)的氨基酸序列， 三疣梭子蟹(BAC79206)與鋸緣青蟹(YP002808458)和擬穴青蟹(YP002808563)之間相似性分別為97.8%和97.5%。COI基因為線粒體基因組基因，其進化速率較快，常被用于近緣物種的系統(tǒng)學(xué)研究[26]。因此本研究獲取的基因序列應(yīng)為Scygonadin基因，但其保守性較低。三疣梭子蟹Scygonadin基因序列與同屬梭子蟹科的鋸緣青蟹和擬穴青蟹相似性不高的原因，可能在于Scygonadin非維持細胞基本生命活動所必需的基因，其面臨的自然選擇壓力小。而且三疣梭子蟹與鋸緣青蟹和擬穴青蟹的生活環(huán)境存在差異，其生活環(huán)境中的菌群結(jié)構(gòu)不同，在自然選擇壓力下Scygonadin基因可能為了應(yīng)對不同致病菌而變異，導(dǎo)致其近緣物種間基因差異較大。

已有關(guān)于鋸緣青蟹Scygonadin基因的研究結(jié)果顯示，該基因主要在性成熟鋸緣青蟹的射精管中轉(zhuǎn)錄表達，與其生殖免疫有關(guān)[10]，與Andropin[15]基因的表達十分相似，但該基因是否與Andropin基因一樣也是雄腺特異性表達基因，不受細菌感染，而是由交配誘導(dǎo)表達等，有待于進一步研究[9]。因此也需要對三疣梭子蟹Scygonadin基因的體內(nèi)表達特性進行研究，了解其在不同物種或不同微生物誘導(dǎo)前后的表達差異，以便為其免疫防御機制的研究奠定基礎(chǔ)。并且對三疣梭子蟹和鋸緣青蟹的抗菌肽Scygonadin基因在抗菌功能方面，以及對特定致病菌感染后三疣梭子蟹和鋸緣青蟹體內(nèi)Scygonadin基因的表達量方面進行差異性研究。