丙烯酸接枝對酶法制備絲素基吸水材料的影響

周步光， 劉月鳴， 王 平， 王 強(qiáng)， 范雪榮

(江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122)

高吸水性樹脂是一種含有強(qiáng)親水基團(tuán)，交聯(lián)網(wǎng)狀的功能高分子材料，具有很強(qiáng)的吸水和保水能力，在環(huán)境治理、土木建筑、抗旱保水等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[1-4]。傳統(tǒng)的高吸水材料如丙烯酸鹽類樹脂存在難生物降解、易造成環(huán)境污染等問題，目前研究開發(fā)生物降解性能的吸水材料已成為趨勢。其中利用高分子吸水樹脂和天然大分子物質(zhì)進(jìn)行共聚反應(yīng)，制備可降解的高吸水樹脂是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[5-7]。

絲素蛋白(SF)是蠶絲的主要組成部分，具有良好的生物相容性和可降解性，含有約10%的酪氨酸酚羥基和大量酰胺鍵鄰位的α-H，有較高的反應(yīng)性，可以通過化學(xué)法(過硫酸銨或過硫酸鉀氧化還原引發(fā)劑)或紫外法(光引發(fā)劑)與外源功能化合物進(jìn)行接枝共聚，構(gòu)建絲素基功能復(fù)合材料[8-9]。相比而言，生物酶催化接枝共聚條件溫和，具有特異性和選擇性，能減輕環(huán)境污染，所以本研究主要側(cè)重于用氧化還原酶體系引發(fā)SF與乙烯基單體的接枝共聚合。實(shí)驗(yàn)以SF為原料，借助于EDC/NHS接枝AA引入雙鍵，促進(jìn)SF與AA和AM分子的辣根過氧化物酶(HRP)體系催化接枝聚合效果，探究接枝AA對制備絲素基吸水材料性能的影響(文中所有縮寫見附表)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蠶絲練白綢(35.5 g/m2，江蘇鑫緣繭絲綢有限公司)；辣根過氧化物酶(HRP酶活>300 U/mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；丙烯酰胺(AM)、丙烯酸(AA)、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)、乙酰丙酮(ACAC)、無水氯化鈣(CaCl2)、乙醇(CH3CH2OH)、嗎啉乙磺酸(MES)等分析純試劑，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 絲素溶液制備

以物質(zhì)的量比n(CaCl2)∶n(CH3CH2OH)∶n(H2O)=1∶2∶8溶液溶解真絲綢[10]，在75℃水浴條件下攪拌3 h使蠶絲充分溶解得到絲素溶液，裝入透析分子質(zhì)量為8000～14 000 u的透析袋中用去離子水對絲素溶解液進(jìn)行透析，直至透析液電導(dǎo)率值小于4 μs/cm，再將絲素溶液離心(10 000 r/min，5 min)去除不溶物，以稱重法標(biāo)定絲素蛋白溶液的濃度，將絲素溶液保存在4℃冰箱中備用。

1.2.2 丙烯酸接枝絲素反應(yīng)

取絲素蛋白和丙烯酸的物質(zhì)的量比為n(SF)∶n(AA)=1∶1，EDC的用量為SF和AA總量的20%，且n(EDC)∶n(NHS)=2∶1。先使用NaOH調(diào)節(jié)MES緩沖液的pH為5.5，然后將一定量的AA、EDC和NHS加入MES緩沖溶液中活化30 min，再加入5 g/L SF溶液反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液透析48 h除去未反應(yīng)的AA后進(jìn)行溶液性能測試。不同對照樣品有純SF溶液、SF(EDC/NHS)。

1.2.3 HRP催化SF-g-AA/AA/AM復(fù)合吸水材料制備

設(shè)定乙烯類單體反應(yīng)物質(zhì)的量比為n(AA)∶n(AM)∶n(MBA)=2∶1∶0.05，加入含有接枝后的絲素蛋白的緩沖溶液中(含AA樣品用NaOH將溶液中和至pH 7.0)，再加入300 μL ACAC和1 mL(1 mg/mL HRP)酶溶液，放入三口燒瓶中通氮?dú)?0 min，逐滴加入100 μL 30% H2O2，加樣結(jié)束后繼續(xù)反應(yīng)4 h。不同對照樣品有SF/AA/AM/MBA、AA/AM/MBA，反應(yīng)后放入聚四氟乙烯模具內(nèi)在-18℃冰箱中冰凍4 h，隨后放入-50℃冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h完成膜材料的制備。

1.3 分析測試方法

1.3.1 游離氨基測試

1)茚三酮測試法。取1 mL絲素反應(yīng)液和2 mL茚三銅溶液加入10 mL 離心管中，沸水煮20 min后冷卻15 min，再加入5 mL含0.2%(W/V)KIO3的乙醇稀釋液中，混勻后用LV-1800測定569 nm的吸光度。(茚三酮溶液的配制方法：0.06 g/mL KH2PO4、0.1 g/mL Na2HPO4、3 g/L果糖、5 g/L茚三酮，加去離子水溶解)。

以甘氨酸做出標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離氨基的濃度：

Am=1.7697Cm-0.0013

(1)

式(1)中：Am是569 nm可見光條件下溶液的吸光度；Cm為谷氨酸濃度(μmol/mL)。

2) OPA測試法。取200 μL絲素反應(yīng)液和4 mL OPA混勻后在室溫條件下反應(yīng)2 min，然后測定混合液在340 nm處的吸光度值；空白樣是在OPA試劑中加入200 μL水。OPA試劑的配制方法：準(zhǔn)確稱取40 mg/mL鄰苯二甲醛/甲醇溶液，然后分別依次加入20%(W/V)的SDS溶液，0.1 mol/L硼砂溶液以及2 μL/mL β-巰基乙醇，需即配即用。

以L-亮氨酸做出標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離氨基的濃度：

An=0.3488Cn-0.0561

(2)

式(2)中：An是340 nm紫外光條件下溶液的吸光度；Cn為L-亮氨酸濃度(μmol/mL)。

1.3.2 雙鍵滴定法

實(shí)驗(yàn)采用溴酸鉀-溴化鉀化學(xué)滴定法來測定溶液中雙鍵的含量[11]。在SF和AA經(jīng)EDC/NHS交聯(lián)體系反應(yīng)后的溶液中加入雙倍體積乙醇析出絲素蛋白，離心(4000 r/min，5 min)。取10 mL上層清液置于250 mL碘量瓶中，加入2 mL丙酮，20 mL溴標(biāo)準(zhǔn)溶液以及5 mL鹽酸溶液充分混勻，置于4℃冰箱中冷藏30 min，取出后再加入15 mL碘化鉀溶液再次冷藏5 min，加入100 mL去離子水，立即用Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液對其進(jìn)行滴定，滴定至溶液呈淡黃色，再加入3 mL淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失即為滴定終點(diǎn)，記下最終使用Na2S2O3溶液的體積，以此來計(jì)算溶液中雙鍵的含量。

溴滴定法滴定3組樣品：樣品1為1.25 g/L丙烯酸稀釋液，相當(dāng)于SF與AA交聯(lián)反應(yīng)前的溶液；樣品2為在EDC/NHS交聯(lián)體系作用下AA和SF反應(yīng)后的溶液經(jīng)乙醇析出沉淀后取得的上清液；樣品3為去離子水，作為空白樣。計(jì)算公式為：

(3)

式(3)中，N1為交聯(lián)反應(yīng)后溶液中剩余AA的物質(zhì)的量(mol)；C為Na2S2O3溶液的濃度(mol/L)；V3為在滴定樣品3時(shí)所使用的Na2S2O3溶液的體積(mL)；V2為在滴定樣品2時(shí)所使用的Na2S2O3溶液的體積(mL)。

(4)

式(4)中，N2為交聯(lián)反應(yīng)中參與反應(yīng)的AA的物質(zhì)的量(mol)；C為Na2S2O3溶液的濃度(mol/L)；V2為在滴定樣品2時(shí)所使用的Na2S2O3溶液的體積(mL)；V1為在滴定樣品1時(shí)所使用的Na2S2O3溶液的體積(mL)。

1.3.3 吸水性能測試

對得到的AA/AM/MBA(a)，SF/AA/AM/MBA(b)，和SF-g-AA/AA/AM/MBA(c)這3組吸水材料進(jìn)行吸水倍率測試[12]。首先稱取一定量的吸水材料樣品，在水中浸漬不同的時(shí)間，后用濾紙吸干表面多余水分，再次稱重，根據(jù)公式(5)計(jì)算材料的吸水倍率Q：

Q=(M2-M1)/M1

(5)

式(5)中，Q為吸水率(g/g)；M0為材料吸水之前的質(zhì)量(g)；M1為材料吸水飽和后的質(zhì)量(g)。

1.3.4 保水性能測試

保水率測試，將吸水飽和后的吸水材料樣品，稱重，常溫(25℃)放置燒杯中24 h，然后取出稱重。由公式(6)計(jì)算保水率R：

(6)

式(6)中，R為吸水材料的保水率(%)；W0為材料吸水飽和后的質(zhì)量(g)；W1為放置24 h后的吸水材料的質(zhì)量(g)。

1.3.5 重復(fù)吸水性測試

重復(fù)吸水性能測試，將吸水飽和后的絲素吸水材料烘干，再次按吸水倍率的測試方法，評價(jià)其重復(fù)吸水性能Q′。

1.3.6 緩釋性能測試

取相同質(zhì)量的各吸水材料樣品分別放進(jìn)等量的0.4%的還原紅染液中，分別浸泡不同的時(shí)間，浸漬后吸取1 mL染液稀釋5倍后，測514 nm處的吸光度值。用吸光度值A(chǔ)的大小來表示吸水材料所具有的包載能力[13]。

1.3.7 差示掃描量熱法

采用TA-Q200差示掃描量熱儀，以10℃/min的升溫速度在0℃～400℃范圍內(nèi)對絲素和吸水材料進(jìn)行熱特性分析。其中，樣品烘干后約取5.0 mg，氮?dú)饬魉贋?0.0 mL/min。

1.3.8 表面形貌觀察

使用SU1510掃描電子顯微鏡(日本日立株式會社)觀察樣品表觀形貌結(jié)構(gòu)，樣品噴金處理，掃描時(shí)的加速電壓為5 kV。

2 結(jié)果與討論

2.1 丙烯酸接枝效果分析

在EDC/NHS交聯(lián)體系作用下，AA接枝SF實(shí)際上是進(jìn)行羧基與氨基的結(jié)合，因此，如果檢測出反應(yīng)液中游離氨基數(shù)量減少，則說明AA與SF確實(shí)反應(yīng)生成了酰胺鍵。但是，由于絲素蛋白分子中本身就存在羧基，會發(fā)生自交聯(lián)，也會導(dǎo)致游離氨基數(shù)量的減少，因此設(shè)置對照試驗(yàn)中則不加入AA。

在弱酸性加熱條件下，氨基酸或肽與茚三酮反應(yīng)會生成藍(lán)紫色的絡(luò)合物。圖1為茚三酮法測得溶液中氨基的含量。

圖1 茚三酮法測溶液中游離氨基含量的變化

從圖1中可以看出，沒有加入EDC/NHS交聯(lián)劑的樣品中游離氨基含量幾乎不變，加入EDC/NHS交聯(lián)劑的SF溶液游離氨基含量隨時(shí)間增加而下降，其中加入AA的樣品游離氨基含量下降得更快。表明加入EDC/NHS交聯(lián)劑之后，SF分子一部分發(fā)生了分子間(內(nèi))的自交聯(lián)，消耗一部分游離氨基；另一部分SF分子中的氨基在EDC/NHS的作用下與AA中的羧基進(jìn)行反應(yīng)，消耗更多的游離氨基。這也間接說明了SF分子確實(shí)與AA分子發(fā)生了接枝反應(yīng)(SF-g-AA)。

同時(shí)采用了OPA法測游離氨基含量，利用游離氨基與OPA(鄰苯二甲醛)進(jìn)行反應(yīng)能夠形成一種黃色絡(luò)合物。圖2為OPA法測得溶液中氨基的含量。

圖2 OPA法測溶液中游離氨基含量的變化

圖2中游離氨基含量的變化與圖1的一致，進(jìn)一步說明了SF分子與AA分子的接枝反應(yīng)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證AA接枝上了SF，采用了溴滴定雙鍵的方法。樣品1～3(詳見實(shí)驗(yàn)方法)消耗Na2S2O3的體積分別為101.7、106.4和114.9 mL，算出交聯(lián)反應(yīng)溶液中剩余的AA為8.5×10-4mol，參與接枝反應(yīng)的AA含量為4.7×10-4mol。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)時(shí)加入的AA的量比交聯(lián)反應(yīng)后溶液中剩余的AA的量大，說明溶液中的AA確實(shí)和SF進(jìn)行了接枝反應(yīng)。

附表(Attached list)

縮寫對照表MES:嗎啉乙磺酸EDC:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽NHS:N-羥基琥珀酰亞胺SDS:十二烷基硫酸鈉ACAC:乙酰丙酮HRP:辣根過氧化物酶SF:絲素蛋白AA:丙烯酸AM:丙烯酰胺MBA:N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺SF-g-AA:絲素接枝丙烯酸

圖3 HRP催化反應(yīng)后各體系的形態(tài)

Fig 3 Shapes of various systems after HRP-catalyzed reaction

2.2 丙烯酸接枝對絲素基吸水材料性能的影響

圖3表示HRP催化反應(yīng)后各體系的形態(tài)，未加入AM的體系呈淡黃色黏稠液體，最終能真正形成吸水材料的是HRP/H2O2催化體系催化形成的AA/AM/MBA(淡黃色透明凝膠狀)、SF/AA/AM/MBA和SF-g-AA/AA/AM/MBA(淡黃色凝膠狀)3種材料，說明AM起到了很好的骨架作用。以下關(guān)于AA對吸水材料性能影響的測定就以這3種為主。

AA與AM共聚物有較強(qiáng)吸水性，在二者體系中加入SF，SF不僅會輔助AM起到材料骨架作用，而且通過與AA、AM的接枝共聚，進(jìn)一步提高材料的穩(wěn)定性。

圖4 膜材料的吸水倍率曲線

圖4所示的是3種吸水材料的吸水倍率隨時(shí)間的變化曲線。由圖4可以看出，AA/AM/MBA吸水材料的吸水量最大，90 min時(shí)趨于飽和狀態(tài)，最終吸水量在3種吸水材料中最大；SF/AA/AM/MBA吸水材料吸水量隨時(shí)間的增加而增加，在1 h左右開始趨于飽和狀態(tài)，最終吸水量在3種吸水材料中最??；SF-g-AA/AA/AM/MBA吸水材料的初始吸水量在3種吸水材料中是最大的，20 min時(shí)吸水倍率就達(dá)到了113.87，1 h左右開始趨向飽和狀態(tài)，最終吸水量在3種吸水材料中居中。SF/AA/AM/MBA吸水材料吸水速率及吸水量均不佳，但當(dāng)絲素蛋白接枝丙烯酸后制成的復(fù)合吸水材料吸水速率快速增加，可在極短的時(shí)間里吸取大量水分，且最終的吸水量也有了很大的提高。這說明使用EDC/NHS交聯(lián)體系使AA接枝到SF上，使SF分子上增加了大量羧基，使SF-g-AA親水性能得到提高。因此SF-g-AA/AA/AM/MBA吸水材料在使用效果上要優(yōu)于SF/AA/AM/MBA。此外，當(dāng)需要快速吸水時(shí)，SF-g-AA/AA/AM/MBA吸水材料具有較大的優(yōu)勢。

圖5 膜材料的保水率

圖5是3種不同吸水材料的保水率。保水率的大小可以說明吸水材料的保濕能力。由圖5可以看出，AA/AM/MBA吸水材料的保水率為96.31%，SF/AA/AM/MBA吸水材料的保水率為93.56%，SF-g-AA/AA/AM/NMBA吸水材料的保水率為94.8%。因此，AA/AM/MBA吸水材料的保濕性最好，而SF-g-AA/AA/AM/MBA吸水材料的保水性能雖不如AA/AM/MBA，但優(yōu)于SF/AA/AM/MBA吸水材料。由此說明，通過接枝AA，使得SF-g-AA形成的吸水材料對水的束縛能力得到提高，因此在通風(fēng)條件下經(jīng)AA接枝后的SF形成的吸水材料比沒有接枝的SF形成的吸水材料保水性能好。

圖6 膜材料的二次重復(fù)吸水倍率曲線

由圖6可以看出3種吸水材料的二次重復(fù)吸水量均在20 min達(dá)到飽和，其中AA/AM/MBA吸水材料二次重復(fù)吸水量最大，而SF/AA/AM/MBA吸水材料的二次重復(fù)吸水量最少。表明AA的接入改變了SF的分子結(jié)構(gòu)，使得最終形成的吸水材料的親水能力得到提高，由此也說明，AA的接枝可以使絲素蛋白類吸水復(fù)合材料的重復(fù)利用性提高。

對吸水材料進(jìn)行緩釋性能的研究可以了解吸水材料對溶液中溶質(zhì)和溶劑的吸收能力。緩釋性能包括包載和釋放兩個(gè)過程，這里通過染液吸光度值的變化率來說明吸水材料的緩釋性能。

圖7 吸水材料對染液吸光度的影響曲線

由圖7可以看出，AA/AM/MBA吸水材料在測試中吸光度雖然隨時(shí)間增加而下降，但下降速度是最慢的，所以該吸水材料對溶質(zhì)的吸收能力最弱；SF-g-AA/AA/AM/MBA吸水材料吸光度下降速度最快，說明該吸水材料對溶質(zhì)的吸收能力最強(qiáng)。由此說明AA/AM/MBA吸水材料的緩釋性能最好，SF-g-AA/AA/AM/MBA吸水材料的緩釋性能最差，但包載能力突出。這說明AA的接枝使得SF分子對濃度較高的溶質(zhì)吸收較快，從而加快其包載能力，使緩釋性能降低。

2.3 絲素基吸水材料的熱性能分析

分析吸水材料SF-g-AA/AA/AM/MBA的熱力學(xué)轉(zhuǎn)變溫度，并與SF、AA/AM/MBA和SF/AA/AM/MBA共聚物作對比。從結(jié)果(圖8)中可明顯看出，120℃以下4個(gè)樣品均有明顯的吸熱峰，主要是自由水和結(jié)合水的蒸發(fā)。SF在280℃處發(fā)生熱分解；AA/AM/MBA吸水材料熱分解發(fā)生在309℃；而SF-g-AA/AA/AM/MBA吸水材料熱分解發(fā)生在303℃較未接枝的略有提高。表明SF的加入使AA/AM類吸水材料的熱性能降低，但經(jīng)過AA接枝后，吸水材料的熱穩(wěn)定性得到提高。由此可以說明接枝AA后的SF分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，具有了AA的良好性能，再與AA、AM在HRP體系的催化作用下發(fā)生接枝共聚反應(yīng)形成的吸水材料熱力學(xué)性能發(fā)生改變，產(chǎn)生耐熱性能較好的吸水材料。

圖8 吸水材料的差示掃描量熱曲線

2.4 吸水材料的表面形貌分析

分別對(a)AA/AM/MBA、(b)SF/AA/AM/MBA和(c)SF-g-AA/AA/AM/MBA 3種凍干膜材料進(jìn)行SEM表面形貌分析，結(jié)果如圖9。

由圖9所示，在500倍掃描電鏡圖下，由于交聯(lián)劑MBA的加入，3種吸水材料表面光滑平整，結(jié)構(gòu)致密[14]，這說明在HRP催化體系的作用下，AA與AM以及交聯(lián)劑MBA的共聚合，以及AA、AM與MBA和絲素分子發(fā)生交聯(lián)使得最終得到的吸水材料表面連續(xù)性較好，因此絲素吸水材料的各方面性能會比較優(yōu)異。

3 結(jié) 論

1)EDC/NHS交聯(lián)體系使AA和SF接枝，導(dǎo)致SF上游離氨基數(shù)量減少，增加乙烯基的數(shù)量，提高了SF的反應(yīng)性；在HRP催化體系的催化作用下，SF將會生成自由基，這些自由基引發(fā)SF分子與乙烯類單體發(fā)生接枝共聚合，實(shí)現(xiàn)SF的改性加工。

2)接枝后的SF在HRP體系的催化作用下，和AA、AM、MBA生成吸水材料。與不添加SF的丙烯酸類吸水材料和添加未接枝SF的吸水材料相比，吸水性能得到改善；保水性和二次重復(fù)吸水性也優(yōu)于絲素基吸水材料。在緩釋性能的測試中SF-g-AA/AA/AM/MBA吸水材料的包載性能最好。

圖9 3種吸水材料的表面形貌

3)在熱力學(xué)方面，不添加SF的吸水材料熱力學(xué)性能最優(yōu)，添加SF的吸水材料熱力學(xué)性能最差，但是，經(jīng)過AA接枝后的SF分子結(jié)構(gòu)得到改善，致使其形成的吸水材料的熱力學(xué)性能得到提高。