干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移

閔家祺 鄔林泉

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰脾外科（南昌 330006）

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡(jiǎn)稱肝癌）是世界范圍內(nèi)惡性腫瘤死亡率排名第三的癌癥［1］。其預(yù)后不良的主要原因是由于在根治性切除術(shù)后仍然有較高的復(fù)發(fā)率，并且缺乏有效的治療方法［2-4］。此外導(dǎo)致肝癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)病原因仍不明確。因此闡明導(dǎo)致肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制是發(fā)現(xiàn)肝癌新的治療途徑和改善預(yù)后的關(guān)鍵。上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）是包括肝癌在內(nèi)的惡性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵［5-6］。EMT的特征是上皮細(xì)胞標(biāo)志物的降低和腫瘤細(xì)胞間充質(zhì)標(biāo)志物的增加。研究報(bào)道肝癌細(xì)胞是可以通過(guò)EMT轉(zhuǎn)化來(lái)增加其侵襲和遷移能力的［7］。因此，研究EMT現(xiàn)象在肝癌發(fā)生發(fā)展中的潛在機(jī)制很有必要。

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3（IFITM3）是IFITM基因家族中的一員［8］。有研究報(bào)道IFITM3基因表達(dá)蛋白所發(fā)揮的功能與細(xì)胞的黏附作用、免疫細(xì)胞的調(diào)控等生長(zhǎng)過(guò)程密切相關(guān)［9-10］。此外，IFITM3在結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中都呈現(xiàn)高表達(dá)［11-14］。并且，在結(jié)腸癌和胃癌中下調(diào)IFITM3的表達(dá)可以抑制癌癥細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［15-16］。這些證據(jù)表明，IFITM3可以調(diào)控腫瘤的進(jìn)展。然而，IFITM3在肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中所扮演的角色并不清楚，且其與EMT現(xiàn)象之間的關(guān)系也并不明確。因此，本研究旨在首次探討IFITM3的表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，以及IFITM3與EMT在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的關(guān)系，揭示IFITM3在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料所有標(biāo)本均來(lái)自于南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2011年1月至2016年12月具有完整隨訪資料的105例原發(fā)性肝癌患者。所有患者均知情同意，開(kāi)展實(shí)驗(yàn)已獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

肝癌細(xì)胞株由上海生物細(xì)胞研究所提供，培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM中，置于37℃，5%CO2細(xì)胞孵箱內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色、Western blot檢測(cè)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞侵襲遷移實(shí)驗(yàn)免疫組化染色、Western blot檢測(cè)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)方法如前期實(shí)驗(yàn)所述［17］。免疫組化實(shí)驗(yàn)中，每張IHC染色圖片的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比由3位病理學(xué)家雙盲評(píng)分。染色強(qiáng)度被評(píng)為：0（陰性）、1（陽(yáng)性）、2（強(qiáng)陽(yáng)性）；陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分為：0（0%）、1（1% ～ 25%）、2（26% ～50%）、3（51% ～75%）、4（76% ～100%）。所得兩組分?jǐn)?shù)相乘即為總分（范圍為0～8），定義小于4分為IFITM3低表達(dá)組，高于4分為IFITM3高表達(dá)組。

1.2.2 總RNA的提取和cDNA的合成根據(jù)OMGA公司提供的總RNA提取試劑盒使用離心柱法提取105例癌與癌旁組織的總RNA，和肝癌細(xì)胞株的總RNA。檢測(cè)RNA溶液的濃度和純度和完整性后，將模板RNA按照TakaRa公司qRT?PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明配置且進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-20℃保存。

1.2.3 qRT?PCR測(cè)定使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，按說(shuō)明書體系進(jìn)行配置。

IFITM3 引物序列：上游：5′?ACTGTCCAAAC?CTTCTTCTCTCC?3′，下游：5′?TCGCCAACCATCT?TCCTGTC?3′。

GAPDH 引物序列：上游：5′?CAGGGCTGCT?TTTAACTCTGGT?3′，下游：5′?GATTTTGGAGGGAT?CTCGCT?3。

用ABI 7500熒光PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定IFITM3的mRNA表達(dá)水平，反應(yīng)條件為95℃30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，60℃收集熒光，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，使用2-ΔΔCT計(jì)算CT值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用Studentt檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Log?rank檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Kaplan?Meier計(jì)算總體生存率和無(wú)瘤存活率，Cox回歸進(jìn)行單、多因素分析。所有統(tǒng)計(jì)采用雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中的所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 IFITM3在肝癌組織學(xué)標(biāo)本中高表達(dá)通過(guò)Western blot方法檢測(cè)105例入組患者癌與癌旁組織學(xué)標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中IFITM3蛋白表達(dá)量明顯較高（圖1A）。免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝癌組織中IFITM3高表達(dá)75例（71.4%），癌旁組織中IFITM3呈高表達(dá)20例（19%）（圖1B）。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)IFITM3在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織（圖1C）。

2.2 IFITM3與肝癌的進(jìn)展密切相關(guān)通過(guò)分析105例臨床患者的病例資料和隨訪，結(jié)合標(biāo)本IF?ITM3的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)：IFITM3的表達(dá)與肝癌衛(wèi)星灶形成、腫瘤包膜、血管侵襲性和TNM分期密切相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表1。此發(fā)現(xiàn)證實(shí)IFITM3高表達(dá)會(huì)促進(jìn)肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移。隨后將105例患者標(biāo)本按照前述免疫組化評(píng)分，根據(jù)IFITM3的表達(dá)量將患者分為兩組：高表達(dá)組69例，低表達(dá)組36例。利用Kaplan?Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)IFITM3高表達(dá)組的總體生存率和無(wú)瘤生存率明顯低于IFITM3低表達(dá)組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。其次，通過(guò)Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)：IFITM3表達(dá)量、血管侵襲、衛(wèi)星灶以及腫瘤包膜情況是評(píng)價(jià)肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P＜0.05；表 2、3）。這些數(shù)據(jù)提示：IFITM3是影響肝癌患者預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志。

2.3 IFITM3在肝癌細(xì)胞株中的蛋白和mRNA表達(dá)情況通過(guò)Western blot和qRT?PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)正常肝細(xì)胞株HL7702，肝癌細(xì)胞株Hep3B、SMCC7721、Huh?7、HCCLM3、MHCC97H 中 IFITM3的蛋白和mRNA表達(dá)量（圖3）。IFITM3的蛋白和mRNA的表達(dá)量在HCCLM3中最高，SMCC7721中最低，且在正常肝細(xì)胞株HL7702中低于各肝癌細(xì)胞株。

圖1 IFITM3在肝癌患者癌與癌旁的蛋白水平表達(dá)Fig.1 The IFITM3 protein expression in HCC tumor and adjacent normal tissues

圖2 IFITM3表達(dá)與總體生存率和無(wú)瘤生存率的關(guān)系Fig.2 Relationship between IFITM3 expression and overall survival rate and tumor free survival rate

圖3 IFITM3在正常肝細(xì)胞系和各株肝癌細(xì)胞系中的mRNA和蛋白表達(dá)情況Fig.3 The mRNA and protein expression of IFITM3 in HL 7702 cell line and HCC cell lines

表1 105例患者IFITM3表達(dá)水平與肝癌臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系Tab.1 Correlation between the expression of IFITM3 in 105 HCC tissues and their clinicopathological characteristics 例

表2 肝癌臨床病理指標(biāo)單因素生存分析Tab.2 Univariate survival analysis of OS and DFS in105 patients with HCC

表3 肝癌臨床病理指標(biāo)多因素生存分析Tab.3 Variate survival analysis of OS and DFS in 105 patients with HCC

2.4 IFITM3誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化分別在IFITM3表達(dá)量最高和最低的肝癌細(xì)胞株HCCLM3和SMCC7721中轉(zhuǎn)染干擾片段shIFITM3?3和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）?IFITM3。通過(guò) Western blot和qRT?PCR明確過(guò)表達(dá)和抑制后的效果（圖4 A、B）。然后，觀測(cè)抑制和過(guò)表達(dá)IFITM3表達(dá)后對(duì)EMT標(biāo)記物的影響（圖4 C）。發(fā)現(xiàn)沉默IFITM3后，E?cadherin表達(dá)量增加，Vimentin和Snail表達(dá)量降低；而過(guò)表達(dá)IFITM3后，結(jié)果相反。表明IFITM3可以誘導(dǎo)肝癌發(fā)生EMT。

2.5 IFITM3促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移最后，利用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)觀測(cè)過(guò)表達(dá)和抑制IF?ITM3表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響（圖5 A、B）。發(fā)現(xiàn)提高IFITM3的表達(dá)可以促進(jìn)肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而降低其表達(dá)則可抑制。證實(shí)，IF?ITM3可以誘導(dǎo)肝癌發(fā)生EMT，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

3 討論

癌癥轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肝癌患者治療失敗和預(yù)后不良的首要原因［15］。而癌癥的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)包括了細(xì)胞蛋白水解，腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移，血管的生成的復(fù)雜變化過(guò)程［16］。在其中，EMT就是腫瘤發(fā)生侵襲遷移的重要一環(huán)［17］。因此，了解肝癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，是發(fā)現(xiàn)肝癌新的治療途徑和改善預(yù)后，提高肝癌患者生存率的關(guān)鍵。

圖4 IFITM3誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化Fig.4 IFITM3 induced epithelial?mesenchymal transition

圖5 IFITM3促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移Fig.5 IFITM3 promotes HCC invasion and metastasis

IFITM3基因是屬于IFITM家族中的一員。在多種惡性腫瘤中IFITM3的表達(dá)都有升高，如：結(jié)腸癌、食管癌、乳腺癌和胃癌等［12-13］。研究表明，IFITM3的表達(dá)在結(jié)腸癌中至關(guān)重要，它是調(diào)控結(jié)腸癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素［11-12］。同時(shí)，IFITM3在乳腺癌中的表達(dá)也與侵襲轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，并且降低乳腺癌中IFITM3的表達(dá)可以降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力，并導(dǎo)致G0/G1細(xì)胞周期阻滯［18］。然而，IFITM3在肝癌中的表達(dá)和功能還不是很明確。本研究首次發(fā)現(xiàn)，IFITM3相對(duì)于癌旁組織，在肝癌組織中的蛋白和mRNA的表達(dá)量明顯增高。且，IFITM3的表達(dá)與腫瘤的衛(wèi)星灶發(fā)生，腫瘤包膜、血管侵襲能力、TNM分期密切相關(guān)。Kaplan?Meier生存分析顯示，相對(duì)于低表達(dá)組，IFITM3高表達(dá)的肝癌患者總體生存率和無(wú)病生存率均明顯下降，說(shuō)明IFITM3表達(dá)上升是不良的預(yù)后因子。同時(shí)，Cox回歸單因素和多因素分析顯示：IFITM3的表達(dá)、腫瘤衛(wèi)星灶、腫瘤包膜和血管侵襲是影響肝癌患者生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

為了探討IFITM3對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響，本研究更進(jìn)一步通過(guò)RNA和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、Transwell和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)：IFITM3可以促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。并且首次發(fā)現(xiàn)，IFITM3的表達(dá)與E?cadherin呈負(fù)相關(guān)，與Vimentin和Snail的表達(dá)呈正相關(guān)，這些結(jié)果表明：在體外實(shí)驗(yàn)中IFITM3可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生從而調(diào)控肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，本研究首次證實(shí)了IFITM3在原發(fā)性肝癌中呈高表達(dá)，可作為腫瘤侵襲潛能的預(yù)測(cè)指標(biāo)，IFITM3的高表達(dá)伴隨著肝癌更低的生存率，增加了癌癥發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)。其次，IF?ITM3可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，從而促進(jìn)肝癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究IFITM3是如何通過(guò)EMT促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移奠定了理論基礎(chǔ)，為后續(xù)研究IFITM3促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了有利證據(jù)。IFITM3將可能為原發(fā)性肝癌的基因治療提供有效的靶點(diǎn)和途徑，其作用值得進(jìn)一步研究。