Treg細(xì)胞在大鼠肝移植術(shù)后感染免疫紊亂中的作用

楊 宇 曲義坤 丁 隆 趙 勇 李艷君 陳立強(qiáng) 孫 權(quán)

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院局部解剖學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

感染是肝移植術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥,亦是移植病人術(shù)后死亡的主要原因之一，包括病毒、細(xì)菌、真菌的感染。然而，在肝移植受者中大部分嚴(yán)重感染源自腹腔內(nèi)細(xì)菌或真菌感染，而且發(fā)生率高，為35%～70%，半數(shù)患者感染發(fā)生在移植術(shù)后2 w內(nèi)。在臨床實(shí)際治療中，發(fā)生細(xì)菌感染的病人，免疫抑制藥物的應(yīng)用與抗感染治療產(chǎn)生了矛盾，這時(shí)為搶救病人的生命，往往需要減量或停用免疫抑制藥物，而這對(duì)移植肝臟的影響尚不得而知。研究〔1〕指出，當(dāng)發(fā)生重癥感染時(shí)，機(jī)體為保護(hù)組織器官的過(guò)度病理性損害，激發(fā)免疫反應(yīng)的同時(shí)，也可能啟動(dòng)了免疫抑制效應(yīng)。在眾多因素中，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的表達(dá)變化引起了廣泛關(guān)注，它能夠分泌免疫抑制因子白細(xì)胞介素(IL)-10和腫瘤壞死因子(TGF)-β，并通過(guò)這兩種細(xì)胞因子發(fā)揮較強(qiáng)的免疫抑制效應(yīng)；而且Treg細(xì)胞能夠抑制免疫排斥反應(yīng)和移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生?？梢?jiàn)感染和免疫排斥反應(yīng)誘導(dǎo)了Treg細(xì)胞的增殖和Th細(xì)胞分化，然而并不是所有增殖的Treg都能表達(dá)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(Foxp)3基因，因此通過(guò)給予不同的單克隆抗體，可以驗(yàn)證在這種免疫紊亂中Treg是否發(fā)揮了免疫學(xué)效應(yīng)，本研究探討Treg在大鼠肝移植術(shù)后感染免疫紊亂中的作用。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)分組 以DA大鼠為供體，LEW大鼠為受體，術(shù)后分為4組，每組30只：急性排斥(G1)組、移植后腹腔感染(G2)組、在G2組處理的基礎(chǔ)上于術(shù)后第2天始加用anti-IL-10和anti-TGF-β單克隆抗體(G3)組，注射量分別為：1.2 mg·kg-1·d-1和0.9 mg·kg-1·d-1，G4組：在G3組處理的基礎(chǔ)上于術(shù)后第2天開(kāi)始加用anti-CD25單克隆抗體，注射量為1.0 mg·kg-1·d-1。每組設(shè)感染前1 d、感染后1、3、5、7 d 5 個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)6 只大鼠。

1.2檢測(cè)指標(biāo) 分別采用流式細(xì)胞術(shù)、單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞亞群、淋巴細(xì)胞功能、肝臟內(nèi)IL-4、干擾素(IFN)-γ、IL-10、TGF-β mRNA。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS6.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)、Kaplan-Meier曲線及對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(Log-Rank)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠生存狀態(tài)觀察 G1組術(shù)后精神狀態(tài)尚可，6 d后出現(xiàn)鞏膜黃染，體重逐漸下降，食欲活動(dòng)均下降，多于術(shù)后13 d左右死亡。G2組感染后5 d部分出現(xiàn)少量口鼻出血，嗜睡狀態(tài)，并有死亡鼠，感染后7 d生存率為37.5%，最長(zhǎng)生存8 d。G3、G4組感染后鞏膜漸進(jìn)性黃染，口鼻、眼角不同程度出血，體重下降，體溫升高，活動(dòng)減少，生存時(shí)間縮短，感染后7 d生存率為只有25%。

2.2外周血淋巴細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)的變化 各組淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量在感染后不斷下降。在感染后5 d CD4+、CD8+在G3、G4組的數(shù)量與G1、G2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)；感染后CD4+/CD8+比值回升，在G3組感染后5 d CD4+/CD8+比值變化顯著，與G1、G4組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，G4組CD4+/CD8+比值回升雖不及G3組顯著，但在感染后3 d各時(shí)間點(diǎn)與G2、G1組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3外周血淋巴細(xì)胞功能的改變 隨術(shù)后(感染后)時(shí)間的增長(zhǎng)，各組淋巴細(xì)胞功能持續(xù)上升。G3組升高更顯著，G3、G4組在感染后3、5、7 d與G1組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。G3與G4組僅在感染后3 d和7 d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.4各組肝內(nèi)IL-4、IFN-γ、IL-10、TGF-β mRNA的表達(dá)水平 G2、G3、G4組IL-4 mRNA表達(dá)水平持續(xù)上升(P<0.05)，與G2組比較，G3、G4組的表達(dá)水平自感染后各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，見(jiàn)表3。G1、G3、G4組IFN-γ mRNA的表達(dá)水平均逐漸增加(P<0.05)，G3組變化顯著。G3、G4組自感染后各時(shí)間點(diǎn)與G2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表4。IL-10、TGF-β mRNA表達(dá)含量在G3組的表達(dá)水平極低，與各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)；在G4組表達(dá)持續(xù)下降，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)與其他三組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。G1、G3、G4組隨著術(shù)后(感染后)時(shí)間增長(zhǎng)，IL-10、TGF-β mRNA表達(dá)逐漸下降，G2組逐漸升高，見(jiàn)表5，表6。

表1 各組術(shù)后(感染后)不同時(shí)間點(diǎn)淋巴細(xì)胞亞群變化

與前一時(shí)間點(diǎn)比較：1)P<0.01；與G1組比較：2)P<0.01；與G2組比較：3)P<0.05；與G3組比較：4)P<0.05

表2 各組術(shù)后(感染后)不同時(shí)間點(diǎn)淋巴細(xì)胞功能的變化

與前一時(shí)間點(diǎn)相比：1)P<0.05；與G1組相比：2)P<0.05,3)P<0.01；與G3組比較：4)P<0.05；表3同

表3 各組術(shù)后(感染后)不同時(shí)間點(diǎn)肝臟內(nèi)IL-4 mRNA表達(dá)含量的變化

表4 各組術(shù)后(感染后)不同時(shí)間點(diǎn)肝臟IFN-γ mRNA的表達(dá)水平變化

與前一時(shí)間點(diǎn)比較：1)P<0.05；與G2組比較：2)P<0.01

表5 各組術(shù)后(感染后)不同時(shí)間點(diǎn)肝臟內(nèi)IL-10 mRNA表達(dá)含量的變化

與G3組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與G4組比較：3)P<0.01；與前一時(shí)間點(diǎn)比較：4)P<0.05,5)P<0.01，表6同

表6 各組術(shù)后(感染后)不同時(shí)間點(diǎn)肝臟TGF-β mRNA的表達(dá)水平變化

3 討 論

感染性疾病往往伴隨著炎癥及組織損傷，因此抗原提呈細(xì)胞(APC)遞呈的抗原不僅有病原體抗原，也有自身抗原，機(jī)體為調(diào)節(jié)這種免疫效應(yīng)，在激活效應(yīng)T細(xì)胞的同時(shí)也激活了Treg，防止過(guò)度的組織損傷。CD4+CD25+T細(xì)胞的激活雖然對(duì)機(jī)體起到了一定的保護(hù)作用，但同時(shí)也抑制了機(jī)體對(duì)病原微生物的清除，致使慢性炎癥發(fā)生，嚴(yán)重的還可能引發(fā)致命性的感染。Stoop等〔2〕研究指出，感染單純皰疹病毒的小鼠體內(nèi)可以分離到大量的CD4+CD25+T細(xì)胞，用anti-CD25抗體拮抗CD25分子，則可提高機(jī)體的抗病毒能力。類似的結(jié)果在對(duì)慢性乙型或丙型肝炎病人的研究中也得到證實(shí)，并且通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究表明，CD4+CD25+T細(xì)胞明顯抑制了抗病毒的特異性效應(yīng)T細(xì)胞的功能〔3～6〕。Belkaid等〔7,8〕研究小鼠真皮利什曼原蟲(chóng)感染時(shí)發(fā)現(xiàn)，在感染部位，CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞均有增殖。體外的實(shí)驗(yàn)〔8〕結(jié)果證實(shí)，CD4+CD25+T細(xì)胞借助于IL-10發(fā)揮抑制效應(yīng)，若用anti-CD25抗體預(yù)處理則可提高機(jī)體對(duì)利什曼原蟲(chóng)的清除。

本研究說(shuō)明抗體的應(yīng)用阻抗了Treg細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞功能的抑制作用，而anti-IL-10/TGF-β單克隆抗體能更有效地阻止已發(fā)生的免疫抑制作用。

Treg不僅能誘導(dǎo)移植免疫耐受，同時(shí)也能阻止GVHD的發(fā)生。Cohen等〔8〕在研究Treg在造血干細(xì)胞移植中作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，少量(3%～5%)的Treg即能抑制GVHD的發(fā)生，如果將這部分Treg剔除，則加速了疾病的發(fā)生；相反，若輸注新鮮分離的Treg則可延緩GVHD的發(fā)生。Johnson等〔9〕、Hoffman等〔10〕也通過(guò)不同的實(shí)驗(yàn)方法直接或間接證明了Treg在抑制GVHD中發(fā)揮了重要作用。

從本研究結(jié)果看出，抑制Treg的增殖部分恢復(fù)了肝移植術(shù)后細(xì)菌感染引起的免疫抑制作用；而應(yīng)用anti-IL-10/TGF-β單克隆抗體其作用高于應(yīng)用anti-CD25單克隆抗體的原因，分析為：Treg雖然依賴于IL-10和TGF-β發(fā)揮作用，但Treg不是唯一能分泌IL-10和TGF-β的細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞具有同樣的作用；而本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，抑制Treg促進(jìn)了Th2細(xì)胞的分化，大鼠體內(nèi)IL-10 mRNA的表達(dá)雖然下降，但并沒(méi)有完全被阻遏，而這部分因子尚能發(fā)揮免疫抑制作用。

綜上，抑制Treg的增殖部分恢復(fù)了淋巴細(xì)胞的功能；抑制Treg的增殖，減少了體內(nèi)IL-10和TGF-β mRNA的表達(dá)水平；Th細(xì)胞的分化不是Treg作用的結(jié)果，但后者可以部分地抑制前者的分化。