決明子多糖對(duì)大鼠青光眼視網(wǎng)膜細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制

張 新 趙 燕 魏 玲

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院眼科，河北 石家莊 050031)

青光眼致盲率位居眼科疾病的第二位，僅次于白內(nèi)障〔1〕。老年性青光眼在老年人中極其常見(jiàn)，且隨增齡發(fā)病率增高〔2〕。青光眼的發(fā)病與多種因素有關(guān)，其中視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞扮演著重要的角色。小膠質(zhì)細(xì)胞在青光眼發(fā)病早期出現(xiàn)增殖和阿米巴樣變化，同時(shí)伴隨大量的前炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α及白細(xì)胞介素(IL)-1β增加，這些炎癥因子會(huì)進(jìn)一步誘發(fā)視網(wǎng)膜的損害〔3，4〕。目前治療青光眼主要通過(guò)手術(shù)及降壓藥對(duì)癥治療，雖然眼內(nèi)壓降低，但視力功能仍然發(fā)生進(jìn)一步的損害，加強(qiáng)手術(shù)后對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的保護(hù)能夠有效緩解疾病。決明子具有清肝明目、潤(rùn)腸通便的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)了決明子具有多種作用，包括降血脂、降血壓、抗氧化等，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、飲食保健等多個(gè)領(lǐng)域〔5～7〕。決明子多糖是決明子的主要有效成分之一。本實(shí)驗(yàn)擬探討決明子多糖對(duì)青光眼大鼠視網(wǎng)膜病變及視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與細(xì)胞 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，購(gòu)于國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞共享平臺(tái)。SD大鼠，雌雄各半，SPF級(jí)，60只，體質(zhì)量230～270 g。購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為 SCXK(冀) 2009-0022。光照和黑暗時(shí)間各12 h，濕度50%～70%，自由飲食和飲水。

1.2主要試劑與儀器 胰蛋白酶(Gibco)；胎牛血清(Hyclone)；DMEM(Hyclone)；青鏈雙抗(Hyclone)；脂多糖(LPS，Sigma)；DMSO(碧云天)；氯仿(北京化工廠)；異丙醇(北京化工廠)；逆轉(zhuǎn)錄及Q-PCR試劑盒(寶生物工程公司)；Trizol Reagent(Life technology)；TUNEL試劑盒(Promega)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)；倒置顯微鏡(Olympus)；超純水機(jī)(Millipore)；酶標(biāo)儀(Thermo)；熒光定量PCR儀(伯樂(lè))；高速低溫離心機(jī)(Eppendorf)；萬(wàn)分之一天平(梅特勒)。

1.3藥物配置 決明子多糖購(gòu)于蘭州沃特萊斯生物科技有限公司。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：決明子多糖使用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液配置成2 g/L的母液，使用時(shí)配置成15，30和60 mg/L的工作液。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，決明子多糖使用蒸餾水配置成25，50和100 mg/ml，按照2 ml/100 g體重灌胃大鼠。

1.4小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 使用含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)，另外添加1%的青鏈雙抗以防止細(xì)胞污染。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)取出凍存的BV2細(xì)胞，于37℃條件下迅速解凍后接種于3.5 mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)36 h。待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，150 g，3 min離心收集細(xì)胞，新鮮培養(yǎng)液重懸后傳代。凍存細(xì)胞使用含有15%DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液，如上述使用胰蛋白酶消化細(xì)胞離心收集后，使用凍存細(xì)胞液重懸BV2細(xì)胞，并置于梯度凍存盒內(nèi)，24 h后轉(zhuǎn)移至液氮中凍存。

1.5小膠質(zhì)細(xì)胞阿米巴原化實(shí)驗(yàn) 體外培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，分為對(duì)照組，LPS組，決明子多糖低、中和高劑量組，每組6孔于96孔板內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。決明子多糖低、中和高劑量組分別加入不同濃度的決明子多糖，使其終濃度分別為15，30和60 mg/L，共孵育12 h。孵育完成后，除對(duì)照組外，其余各組均加入LPS使其終濃度為1 mg/L。孵育12 h后使用冷丙酮固定，送本院病理科使用蘇木精染色。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞阿米巴樣變化，6個(gè)樣品孔，每孔計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，記錄阿米巴原化的細(xì)胞數(shù)量。

1.6小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α及IL-1β基因表達(dá)實(shí)驗(yàn) 如1.5所述分別加入決明子多糖及LPS刺激細(xì)胞，孵育完成后使用PBS沖洗細(xì)胞，并加入Trizol裂解細(xì)胞，按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取RNA。使用寶生物逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用儀器自帶程序按2-△△Ct法計(jì)算TNF-α及IL-1β基因表達(dá)量。TNF-α引物為5′-GAAAGCAAGCAGCCAACCA-3′及5′-CGGATCATGCTTTCTGTGCTC-3′。IL-1β引物為5′-AATGACCTGTTCTTTGAAGTTGA-3′及5′-TGATGTGCTGCTGCG AGATTTGAAG-3′；GAPDH內(nèi)參基因?yàn)?′-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3′及5′-CTTACTCCTTGGAGGCCAT G-3′。擴(kuò)增條件為95℃，30 s，1個(gè)循環(huán);95℃，5 s，60℃，35 s，40個(gè)循環(huán)。

1.7青光眼大鼠造模 60只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組，決明子多糖低、中和高劑量組(500，1 000和2 000 mg/kg)，每組12只。 除對(duì)照組外，其余48只大鼠使用手術(shù)法造青光眼模型。大鼠使用10%水合氯醛麻醉后開(kāi)眼瞼，使用精細(xì)剪剪開(kāi)球結(jié)膜，暴露上直肌、下直肌，使用體視顯微鏡找到鞏膜上靜脈，并使用烙鐵針烙斷3條鞏膜上靜脈，以遠(yuǎn)端上靜脈變白作為烙閉成功的指標(biāo)。手術(shù)3 d后開(kāi)始灌胃給藥，決明子多糖組給予相應(yīng)劑量的決明子多糖，對(duì)照和模型組給予等量蒸餾水，共灌胃3 w。

1.8大鼠眼內(nèi)壓測(cè)定 于術(shù)后第3日及3 w灌胃完成后上午8～10點(diǎn)測(cè)定大鼠眼內(nèi)壓變化。大鼠使用奧布卡因滴眼液麻醉，并使用Goldmann鼠用眼壓測(cè)定儀測(cè)定大鼠左眼眼內(nèi)壓。每只測(cè)定3次取均值。

1.9大鼠視網(wǎng)膜TUNEL及HE染色 灌胃給藥3 w后，大鼠使用乙醚過(guò)量麻醉處死，迅速分離大鼠左右眼，使用PBS溶液沖洗后，沿角膜剪開(kāi)去除晶狀體及玻璃體，操作輕柔避免損傷視網(wǎng)膜。將剩余部分全部放入4%多聚甲醛中固定，送檢本院病理科制作切片，其中左眼于病理科HE染色并觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)變化，右眼切片TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件，多組比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1決明子多糖對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞阿米巴原化的影響 如圖1所示，LPS組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的阿米巴原化。對(duì)照組、LPS組、決明子多糖低、中和高劑量組的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞阿米巴原化率分別為(0.0±0.0)%，(72.8±4.3)%，(51.2±6.5)%，(37.22±3.7)%，(23.9±2.8)%。與LPS組細(xì)胞阿米巴原化率相比，決明子多糖低(P<0.05)、中(P<0.01)和高劑量組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞阿米巴原化率明顯降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 小膠質(zhì)細(xì)胞阿米巴樣變化(HE，×400)

2.2決明子多糖對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-1β基因表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，LPS組TNF-α和IL-1β基因表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)。與LPS組比較，決明子多糖低、中和高劑量組的TNF-α基因表達(dá)水平顯著性下調(diào)(P<0.05或P<0.01)；決明子多糖高劑量組的IL-1β水平顯著性下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3決明子多糖對(duì)青光眼大鼠眼內(nèi)壓的影響 與對(duì)照組相比，模型組在造模3 d后及給藥3 w后左眼眼內(nèi)壓顯著性升高(P<0.01)。與模型組相比，決明子多糖低、中和高劑量組在造模3 d后及給藥3 w后左眼眼內(nèi)壓均無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組TNF-α和IL-1β的基因表達(dá)

與對(duì)照組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與LPS組比較：3)P<0.01，4)P<0.05；表2同

表2 各組大鼠眼內(nèi)壓

2.4決明子多糖對(duì)青光眼大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組〔(0.0±0.0)個(gè)〕相比，模型組視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)顯著性增加〔(11.2±1.5)個(gè)，P<0.01〕。與模型組大鼠相比，決明子多糖低、中和高劑量組視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)顯著性減少〔分別為(8.8±1.0)個(gè)，(8.3±1.6)個(gè)，(6.5±1.3)個(gè)；P<0.05〕。

2.5決明子多糖對(duì)青光眼大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響 對(duì)照組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，視網(wǎng)膜細(xì)胞排列整齊，可見(jiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)三層分布。模型組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)混亂，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層交錯(cuò)混雜。決明子多糖低劑量組可見(jiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層，但神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層有損傷。決明子中劑量組及高劑量組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層均未見(jiàn)明顯損傷。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)圖(×200)

3 討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞是介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)免疫應(yīng)答的效應(yīng)細(xì)胞，在對(duì)抗感染等應(yīng)激性疾病的過(guò)程中起著重要的作用〔8〕。在正常狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞可以及時(shí)清理機(jī)體內(nèi)衰老或壞死的神經(jīng)細(xì)胞。而在應(yīng)激狀態(tài)下，如青光眼或感染狀態(tài)，小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)迅速分化，發(fā)生阿米巴樣改變，成為免疫效應(yīng)細(xì)胞。在應(yīng)激狀態(tài)早期，小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的前炎癥因子如TNF-α和IL-1β等能夠有效保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞。但隨著病程延長(zhǎng)，小膠質(zhì)細(xì)胞引起的炎癥會(huì)損傷正常的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，從而加劇損傷〔9〕。決明子是豆科植物決明的干燥種子，以其清肝明目的作用而命名。《本草綱目》記載，決明子能夠除肝膽風(fēng)熱，淫膚白膜，青盲?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究亦證實(shí)了決明子具有明目的功效〔10〕。本實(shí)驗(yàn)首次從體外及體內(nèi)兩個(gè)方面探討了決明子多糖對(duì)大鼠青光眼視網(wǎng)膜細(xì)胞的保護(hù)作用。證實(shí)了決明子能夠通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞阿米巴樣變化，從而抑制其炎癥因子的產(chǎn)生，起到保護(hù)青光眼大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的作用。而在體實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，決明子多糖保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞的作用與抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡有關(guān)，但其直接降低眼內(nèi)壓的作用并不明顯。大鼠眼內(nèi)壓測(cè)定的誤差較大，本實(shí)驗(yàn)采用同一大鼠測(cè)定3次的方法減小誤差以獲得準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。