慢性鉛暴露對大鼠腦組織PARP1基因mRNA表達影響及與氧化應(yīng)激的關(guān)系

李煒娟 楊天富 宛 明 徐群英 任清風(fēng) 張中偉 馮建高 肖元梅

(南昌大學(xué)撫州醫(yī)學(xué)院，江西 撫州 344000)

鉛是一種能夠造成多器官損害的重金屬毒物，與其他器官系統(tǒng)相比較，神經(jīng)系統(tǒng)損傷最敏感，尤其是正在生長發(fā)育中的大腦〔1〕。氧化應(yīng)激損傷被認為是鉛致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的可能機制之一。氧化應(yīng)激是指機體在一些有害因素的作用下，體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，自由基在體內(nèi)大量堆積，引起DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)氧化損傷。在DNA氧化損傷修復(fù)過程中，腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(PARP)1作為DNA損傷的分子感受器，在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)DNA損傷時被激活，活化的PARP1介導(dǎo)堿基切除修復(fù)復(fù)合物參與受損DNA修復(fù)〔2,3〕。本研究主要分析慢性鉛暴露后大鼠大腦皮質(zhì)、小腦、海馬組織中X線修復(fù)交叉互補基因(XRCC)1基因mRNA表達水平變化及其與腦組織鉛含量和氧化應(yīng)激指標(biāo)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 三水合乙酸鉛購于西隴化工廠(分析純)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；RNA提取試劑盒購于上海索萊寶生物科技公司；引物由Invitrogen公司合成；反式DNA標(biāo)記購于全式金公司；Gill green核酸電泳檢測專用染料購于北京華越洋生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Thermo公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購于美國Synoptics公司；PCR擴增儀購于美國 BIO-RAD；6×加樣緩沖液購于全式金公司；瓊脂糖購于BIOWEST AGAROSE 西班牙；多功能酶標(biāo)儀購于美國 Molecular Devices；鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；AA-6300C型石墨爐原子吸收分光光度計購于日本島津公司；AAS SOLAAR M6石墨爐原子吸收分光光度計購于Thermo公司；722可見分光光度計購于上海精密科學(xué)儀器公司；低溫高速離心機購于德國 Hettich。

1.2實驗動物分組及處理 40只剛斷乳SPF級健康、雄性SD大鼠，購自北京維通利華實驗動物有限公司〔動物合格證號：SCXK(京)2012-0001〕，體重90～100 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，根據(jù)體重按隨機分組法分為對照組和4個暴露組，每組8只，分別自由飲用去離子水(對照組)、100 mg/L乙酸鉛溶液(最低劑量組)、200 mg/L乙酸鉛溶液(低劑量組)、400 mg/L乙酸鉛溶液(中劑量組)、800 mg/L乙酸鉛溶液(高劑量組)，動物染毒和處理方法參照李煒娟等〔2〕的方法。

1.3檢測指標(biāo)及方法 ①RT-PCR檢測PARP1基因mRNA表達：提取大鼠腦組織RNA；檢測RNA純度濃度后進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；進行聚合酶鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)；制備100 ml 2.0%瓊脂糖凝膠；制備膠板；加樣；電泳；凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果〔4〕；②腦組織經(jīng)消化后測定鉛含量〔5〕；③SOD、MDA、GSH-PX測定參照肖元梅等〔6～8〕的方法。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析,進一步兩兩比較用最小極差法(LSD-t)法，相關(guān)分析用Pearson分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大腦皮質(zhì)、小腦、海馬中PARP1基因mRNA表達情況比較 最低劑量組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)、小腦和海馬中PARP1基因mRNA表達量均顯著低于對照組(均P<0.05)，大腦皮質(zhì)、小腦和海馬4個染鉛劑量組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 各組腦組織中PARP1基因mRNA的表達水平

與對照組相比：1)P<0.05

M：DNA marker；1～5泳道依次為：對照組、最低劑量組、低劑量組、中劑量組、高劑量組圖1 各組大腦皮質(zhì)、小腦和海馬中PARP1基因mRNA的表達

2.2各組腦組織中鉛含量的變化 最低劑量組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大腦皮質(zhì)、小腦、海馬中鉛含量均顯著高于對照組(均P<0.05)，低劑量組大腦皮質(zhì)及海馬中鉛含量，中、高劑量組大腦皮質(zhì)、小腦、海馬中鉛含量均顯著高于最低劑量組(均P<0.05)；中劑量組大腦皮質(zhì)、海馬及高劑量組大腦皮質(zhì)、小腦、海馬中鉛含量均顯著高于低劑量組(均P<0.05)；高劑量組大腦皮質(zhì)及海馬中鉛含量顯著高于中劑量組(均P<0.05)。見表2。

表2 各組腦組織中鉛含量比較

與對照組比較：1)P<0.05；與最低劑量組比較：2)P<0.05；與低劑量組比較：3)P<0.05；與中劑量組比較：4)P<0.05；下表同

2.3各組腦組織SOD、MDA和GSH-PX水平比較 最低劑量組大腦皮質(zhì)及小腦SOD、GSH-PX含量，低劑量組大腦皮質(zhì)及小腦SOD、GSH-PX含量、海馬SOD含量，中、高劑量組大腦皮質(zhì)、小腦、海馬中SOD、GSH-PX含量均顯著高于對照組(均P<0.05)；最低劑量組海馬MDA ，低劑量組小腦及海馬MDA，中、高劑量組大腦皮質(zhì)、小腦、海馬MDA含量均顯著高于對照組(均P<0.05)。并隨著染鉛劑量的升高，各腦組織SOD、GSH-PX含量基本呈逐漸下降趨勢而MDA水平基本呈逐漸升高趨勢，但只有中、高劑量組大腦皮質(zhì)、小腦、海馬SOD含量，低、中、高劑量組小腦MDA，高劑量組大腦皮質(zhì)MDA較最低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；高劑量組大腦皮質(zhì)SOD、小腦SOD及MDA、海馬SOD 含量較低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；高劑量組小腦MDA含量較中劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4PARP1 mRNA表達量與腦組織鉛含量和氧化應(yīng)激指標(biāo)相關(guān)性 大腦皮質(zhì)、小腦和海馬PARP1 mRNA表達量均與其組織鉛含量及MDA含量呈顯著負相關(guān)(P<0.05，P<0.01)，與SOD含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，大腦皮質(zhì)及小腦PARP1 mRNA表達量與GSH-PX含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05,P<0.01)。見表4。

表3 各組腦組織SOD、MDA、GSH-PX水平比較

表4 PARP1 mRNA表達量與腦組織鉛含量和氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性

1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

PARP1活化方式有2種：①N末端鋅指結(jié)構(gòu)與DNA斷裂處結(jié)合活化PARP1；②第3鋅指結(jié)構(gòu)通過增強C末端催化區(qū)域活性使PARP1構(gòu)象發(fā)生改變，進而活化PARP1〔9～11〕。DNA單鏈斷裂時，PARP1識別有缺口的DNA并與之結(jié)合被激活，活化的PARP1與DNA損傷處結(jié)合形成同型二聚體，催化底物煙酰胺腺嘌呤核苷酸(NAD+)轉(zhuǎn)化為二磷酸腺苷(ADP)核糖基化蛋白受體，后者與核受體蛋白結(jié)合形成帶有大量負電荷的多聚ADP核糖鏈，多聚ADP核糖鏈達到一定長度后降解產(chǎn)生聚ADP核糖，聚ADP核糖介導(dǎo)堿基切除修復(fù)復(fù)合物(XRCC1作為腳手架，與聚合酶β、DNA連接酶Ⅲ結(jié)合形成的復(fù)合物〔12〕)參與DNA單鏈斷裂處的修復(fù)〔13〕，而過度的PARP1活化由于含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)依賴性和非依賴性細胞凋亡、NAD+和三磷酸腺苷(ATP)能量耗竭、Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶活性增高和炎性介質(zhì)過度表達等原因?qū)е录毎劳?。因此，輕度的PARP1活化有利于細胞存活，而過度的PARP1活化則導(dǎo)致細胞死亡。

研究顯示，輕中度氧化應(yīng)激誘導(dǎo)DNA損傷時，PARP1 mRNA表達增加，才能使細胞存活；嚴(yán)重氧化應(yīng)激誘導(dǎo)DNA損傷時，PARP1 mRNA表達下降有利于神經(jīng)細胞存活〔14〕。陳瑞〔15〕研究表明，JWA表達正常的細胞中，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)PARP1 mRNA表達明顯下降，同時XRCC1與PARP1之間存在著一種特殊的聯(lián)系(即XRCC1負調(diào)控PARP1的表達)。研究顯示，氧化應(yīng)激損傷時，PARP1 mRNA表達量下降，PARP1 mRNA的低表達與癌變密切相關(guān)〔16〕。本研究表明慢性鉛暴露后大鼠腦組織PARP1 mRNA表達量與氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)。慢性鉛暴露使大鼠大腦皮質(zhì)、小腦、海馬PARP1 mRNA表達量下降，且與組織鉛含量負相關(guān)，說明鉛可通過誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激損傷而影響PARP1 mRNA表達。