硫化氫對(duì)長(zhǎng)期過(guò)量飲酒小鼠心肌纖維化及miR-221表達(dá)的影響

肖 婷 宋宗仁 劉鴻濤 郭亞芹 張 樂(lè) 王 芳 楊 軍

(深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 深圳 518110)

心肌在長(zhǎng)期過(guò)量飲酒情況下，可出現(xiàn)許多的病理改變，心肌纖維化是其中重要的病理改變之一〔1〕。而心肌纖維化常常是導(dǎo)致許多心血管疾病發(fā)生心律失常和發(fā)展為心力衰竭的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。微小RNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度20～25個(gè)核苷酸大小、機(jī)體內(nèi)源性表達(dá)的單鏈非編碼RNA分子，具有負(fù)向調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能。miRNAs通過(guò)與靶mRNA的3′-非編碼區(qū)特定序列互補(bǔ)配對(duì)，引起翻譯抑制或結(jié)合后降解，進(jìn)而對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后負(fù)向調(diào)控。基于此生物學(xué)功能，其參與了調(diào)控機(jī)體許多重要的生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化、衰老及癌變〔2～4〕。有證據(jù)表明，miRNAs可通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與調(diào)控心肌纖維化過(guò)程〔5〕。研究證實(shí)，硫化氫(H2S)在心血管系統(tǒng)中具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，可在多種心肌損傷模型中發(fā)揮心肌保護(hù)作用〔6〕。有研究還顯示H2S可改善長(zhǎng)期攝入酒精導(dǎo)致的左室重構(gòu)〔7〕。本研究旨在探討H2S對(duì)酒精性心肌纖維化的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品與試劑 44只健康雄性昆明小鼠，體重16～21 g，由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。硫氫化鈉(NaHS)和DL-炔丙基甘氨酸(PAG)由 Sigma公司提供。Trizol試劑由Invitrogen公司提供。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由Fermentas公司提供。

1.2方法

1.2.1分組、模型建立及干預(yù)方案 44只小鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型組、NaHS組和PAG組，其中對(duì)照組與模型組每組各10只，NaHS組與PAG組每組各12只。實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，使小鼠適應(yīng)環(huán)境。模型組、NaHS組及PAG組小鼠經(jīng)連續(xù)12 w每日自由飲用4%(V/V)的乙醇水溶液(4%的乙醇水溶液是唯一飲用水源)制作酒精性心肌纖維化模型〔8〕，對(duì)照組予以每日自由飲用清潔水。造模開(kāi)始的同時(shí)，NaHS組給予每天腹腔注射NaHS溶液(50 μmol/kg)，PAG組給予每天腹腔注射PAG溶液(40 mg/kg)。對(duì)照組與模型組給予每天腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.2標(biāo)本采集 造模第12 w末時(shí)，采用腹腔注射水合氯醛對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，固定小鼠，打開(kāi)胸腔，快速取出心臟，去除心包膜、血管等其他組織，用冰生理鹽水沖洗干凈，濾紙弄干。取左室部分心肌迅速放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片，用于行VG染色和Ⅰ型膠原免疫組化。取部分左室心肌組織凍存于-80℃冰箱，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)。

1.2.3VG染色觀察心肌膠原沉積 取4%多聚甲醛固定后的心肌組織，行常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋后，制備組織切片，切片厚度約4 μm，然后進(jìn)行VG染色，間質(zhì)膠原纖維呈紅色，于光鏡下觀察。

1.2.4免疫組化檢測(cè)心肌組織Ⅰ型膠原表達(dá) 石蠟包埋4%多聚甲醛固定的心肌組織，制備組織切片。切片常規(guī)脫蠟和水化，3%過(guò)氧化氫(H2O2)處理，抗原修復(fù)。以正常山羊血清封閉，滴加稀釋一抗Ⅰ型膠原抗體(1∶100)，37℃孵育90 min。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗，滴加二抗，37℃孵育15 min，PBS漂洗，顯色劑顯色。然后以蘇木素復(fù)染，脫水、透明，封片，鏡檢。最后在顯微鏡下進(jìn)行觀察，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色定位明確的顆粒物質(zhì)為陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。

1.2.5RT-qPCR檢測(cè)miR-221的表達(dá) 取-80℃凍存的心肌組織，按照Trizol試劑說(shuō)明提取心肌組織總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和濃度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，按照說(shuō)明轉(zhuǎn)錄得到cDNA。選用U6為內(nèi)參。引物序列(5′-3′)如下：U6：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT；mir-221：ACCTGGCATACAATGTAGATTTC。PCR反應(yīng)體系如下：Template(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)1 μl，引物A (10 μmol/L)0.5 μl，引物B(10 mol/L)0.5 μl，PCR H2O 13 μl，2×SYBR Green PCR混合物15 μl 。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10 min,隨后進(jìn)入循環(huán)，95℃變性5 s,60℃退火延伸30 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1心肌組織VG染色結(jié)果 模型組心肌組織中紅染的膠原纖維較對(duì)照組明顯增多，即心肌纖維化加重。NaHS組心肌組織中紅染的膠原纖維較模型組明顯減少，即心肌纖維化減輕。PAG組與模型組相比，紅染膠原纖維進(jìn)一步增多，心肌纖維化更為明顯。見(jiàn)圖1。

2.2Ⅰ型膠原蛋白免疫組化結(jié)果 模型組心肌組織中棕黃色陽(yáng)性物質(zhì)顯著多于對(duì)照組，即模型組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組。NaHS組棕黃色陽(yáng)性物質(zhì)較模型組顯著減少，即NaHS組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)較模型組顯著降低。相反，PAG組與模型組相比，棕黃色陽(yáng)性物質(zhì)進(jìn)一步明顯增多，即Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)進(jìn)一步顯著升高。見(jiàn)圖2。

圖1 各組心肌組織VG染色結(jié)果(×100)

圖2 各組心肌組織Ⅰ型膠原的表達(dá)(DAB，×400)

2.3各組心肌組織miR-221表達(dá)水平比較 模型組心肌組織中miR-221表達(dá)水平(1.67±0.12)顯著高于對(duì)照組(1.00±0.05，P<0.05)，NaHS組心肌組織中miR-221的表達(dá)水平(1.28±0.03)較模型組顯著下降(P<0.05)，PAG組(2.12±0.12)與模型組相比，miR-221表達(dá)水平進(jìn)一步明顯增高(P<0.05)。

3 討 論

研究證實(shí)長(zhǎng)期大量飲酒可導(dǎo)致出現(xiàn)以心臟擴(kuò)大、肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂、收縮功能下降為特征的心肌重構(gòu)〔9,10〕。同時(shí)，心肌纖維化也是慢性酒精性心肌損傷發(fā)生的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。過(guò)量攝入酒精可使心肌細(xì)胞受損，從而繼發(fā)心肌成纖維細(xì)胞增殖和基質(zhì)膠原纖維蛋白分泌的增加，形成心肌纖維化〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)了長(zhǎng)期過(guò)量飲酒可導(dǎo)致心肌纖維化發(fā)生。

H2S是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種小分子氣體遞質(zhì)，可以自由滲入細(xì)胞膜發(fā)揮生物效應(yīng)。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，H2S可通過(guò)酶促反應(yīng)途徑產(chǎn)生，由磷酸吡哆醛-5′-磷酸依賴酶，主要為胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)，催化底物L(fēng)-半胱氨酸而成。其中CBS主要高表達(dá)于腦組織中，而CSE 主要存在心血管組織中。H2S在心血管系統(tǒng)中具有重要的調(diào)節(jié)功能，參與調(diào)控許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。Mani等〔12〕發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性H2S可通過(guò)抑制血管內(nèi)膜的增殖和黏附分子的表達(dá)保護(hù)血管免受粥樣硬化損傷，而減少內(nèi)源性H2S生成可加速血管動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。Zhou等〔13〕在鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病心肌病模型中發(fā)現(xiàn)，H2S可通過(guò)抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗細(xì)胞凋亡等機(jī)制減慢糖尿病心肌病的發(fā)展。本研究結(jié)果提示H2S可有效減輕酒精性心肌纖維化。

有研究發(fā)現(xiàn)miRNAs參與高血壓、心肌缺血、心肌梗死、心力衰竭、心肌病等多種心血管疾病的心肌纖維化過(guò)程，具體機(jī)制為直接抑制多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)或參與調(diào)控多條與心肌纖維化相關(guān)的信號(hào)通路〔14〕。miR-221是一種廣泛存在于各種組織中的miRNA。蘇明〔15〕通過(guò)構(gòu)建心肌特異miR-221轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠在大約1月齡時(shí)心臟明顯擴(kuò)大，心臟重量指數(shù)明顯增大，心肌纖維化程度顯著增加。而其具體機(jī)制與miR-221調(diào)控p27/CDK2/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路介導(dǎo)的自噬有關(guān)。長(zhǎng)期過(guò)量飲酒在引起小鼠心肌纖維化的同時(shí)，可以上調(diào)miR-221的表達(dá)，這提示miR-221可能參與了酒精性心肌纖維化的發(fā)展過(guò)程。而H2S在減輕酒精性心肌纖維化的同時(shí)可下調(diào)miR-221的表達(dá)，這提示下調(diào)miR-221的表達(dá)可能是H2S減輕酒精性心肌纖維化的重要內(nèi)在機(jī)制。

綜上所述，我們初步認(rèn)為H2S具有改善長(zhǎng)期過(guò)量飲酒導(dǎo)致的心肌纖維化的作用，其內(nèi)在機(jī)制可能與H2S下調(diào)miR-221的表達(dá)有關(guān)，而其詳細(xì)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。