凝血因子X 激活劑效價(jià)測(cè)定方法的建立及驗(yàn)證

崔亮亮，李秀琳，李秀娜，丁忠福，石皎，孫東，薛雁

作者單位：110171 沈陽，遼寧遠(yuǎn)大諾康生物制藥有限公司

蛇毒中含有多種能夠影響哺乳動(dòng)物凝血系統(tǒng)的酶類，這些酶類與凝血機(jī)制級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)中的各個(gè)凝血因子之間有比較嚴(yán)格的專一性作用，其中凝血因子 X 激活劑（coagulation factor X activator，F(xiàn)XA）是一種能夠直接作用于凝血因子 X（coagulation factor X，F(xiàn)X）的具有蛋白水解酶特性的酶類，在蝰亞科、蝮亞科、眼鏡蛇科等蛇毒中分布廣泛[1]。人體正常的血液系統(tǒng)處于促凝-抗凝之間的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體受到外源傷害或疾病干擾時(shí)，機(jī)體的凝血平衡被打破，啟動(dòng)凝血瀑布級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)以抵抗外來因素的影響。然而無論是外源凝血途徑還是內(nèi)源凝血途徑，最終均是凝血因子 FX 被激活為活化狀態(tài)，即活化的凝血因子 X（coagulation factor X activated，F(xiàn)Xa），F(xiàn)Xa 激活凝血酶原生成凝血酶，發(fā)揮凝血作用[2]。巴西矛頭蝮蛇蛇毒中分離得到的凝血因子 X 激活劑，為分子量 80000 D 左右的單一組分的糖蛋白，含有一條重鏈和兩條輕鏈，具有鈣離子依賴性。體外研究表明，在 Ca2+存在的條件下 FXA 可以特異性地水解 FX 生成 FXa，近而使人-枸櫞酸血漿凝固[3-4]。體內(nèi)試驗(yàn)研究表明，F(xiàn)XA 可明顯縮短正常小鼠的斷尾出血時(shí)間，具有較好的止血作用，鑒于 FXA 高度特異性作用特點(diǎn)，初步判斷對(duì) A 型血友病小鼠也會(huì)有較好的止血效果[5]，可緩解目前臨床僅靠補(bǔ)充凝血因子 VIII 治療 A 型血友病的局面，降低患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，具有較好的藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值。

目前，根據(jù)作用底物的不同可將 FXA 的活性測(cè)定方法分為兩大類：第一大類為天然底物法，即以人血漿為底物，以 FXA 加入血漿發(fā)生凝固的時(shí)間來進(jìn)行 FXA 的活性測(cè)定。該法在 20 世紀(jì) 80 年代初得到普遍應(yīng)用，方法常規(guī)[6]。第二大類為生色底物法，即通過 FXa 水解生色底物產(chǎn)生有特征吸收的生色產(chǎn)物進(jìn)行的活性測(cè)定，又可分為二步法和FXA 外標(biāo)法。二步法即在 FXA 作用于 FX 一段時(shí)間后加入終止劑，同時(shí)加入生色底物，根據(jù)特定時(shí)間內(nèi) FXa 的生成量計(jì)算 FXA 的活性[7]。FXA 外標(biāo)法，通過檢測(cè) FXA 標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度在 405 nm 處對(duì)硝基苯胺（pNA）的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品效價(jià)。我們建立的方法是以 FX為反應(yīng)底物，F(xiàn)XA 激活 FX 生成 FXa，F(xiàn)Xa 水解生色底物生成在 405 nm 波長(zhǎng)有最大吸收顯黃色的對(duì)硝基苯胺，在FX 和生色底物足量的條件下，對(duì)硝基苯胺濃度僅與 FXA的活性相關(guān)且在一定的范圍內(nèi)具有線性相關(guān)性，依據(jù) 1 min內(nèi)生成對(duì)硝基苯胺的物質(zhì)的量計(jì)算 FXA 的活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 人源凝血因子 X 購自美國 Merck公司，批號(hào)：D00175389，1.4 mg/ml，119.4 U/mg；人凝血因子 X 購自 Hyphen BioMed 公司，批號(hào)：141104B，8 U/瓶；生色底物 S-2765（N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl，批號(hào)：N1143454，25 mg；Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl，批號(hào)：150410，10 mg）分別購自 Cheromogenix 和 Aglyco 公司；FXA 溶液購自遼寧遠(yuǎn)大諾康生物制藥有限公司，批號(hào)：150107、150203、150406；Tris、HCl、CaCl2、EDTA、苯甲脒為國產(chǎn)分析純。Evolvtion220 和 Lambda 35 型溫控紫外分光光度儀分別購自 Thermo 和 Perkin Elmer 公司。

1.1.2 試劑配制 緩沖溶液 1：稱取 Tris 1.210 g、NaCl 1.755 g、苯甲脒 0.031 g、CaCl20.111 g 溶于 80 ml 蒸餾水中，用 2 mol/L 的 HCl 溶液調(diào) pH 到 7.5，定容至 100 ml。緩沖溶液 2：稱取 Tris 12.1 g、NaCl 4.387 g、EDTA 1.861 g、溶于 80 ml 蒸餾水中，用 2 mol/L 的 HCl 溶液調(diào) pH 到8.3，定容至 100 ml。緩沖溶液 3：稱取 Tris 0.242 g、NaCl 0.585 g、苯甲脒 0.01557 g、溶于 80 ml 蒸餾水中，用 2 mol/L的 HCl 溶液調(diào) pH 到 7.4，定容至 100 ml。稀釋液：稱取Tris 0.121 g，溶于 80 ml 蒸餾水中，用 2 mol/L 的 HCl 溶液調(diào) pH 8.0，定容至 100 ml。生色底物 S-2765 溶液：用蒸餾水溶解，稀釋至 1.5 mg/ml。FX 溶液：用緩沖溶液 3 將FX 溶液稀釋至 1.25 U/ml。取 FXA 溶液，用稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度，作為供試品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)過程 取供試品溶液、緩沖液 1、FX 溶液各200 μl 加至比色皿混勻，37 ℃ 溫控紫外分光光度儀中保溫 10 min，立即加入 200 μl 緩沖液 2、200 μl S-2765 溶液，混勻，37 ℃ 條件下，在 405 nm 處測(cè)定 0、1、2、3 min的吸收值A(chǔ)0、A1、A2、A3，A3–A0= ΔA，以供試品稀釋液作為空白對(duì)照。供試品進(jìn)行適量稀釋，使測(cè)試的對(duì)硝基苯胺濃度為 0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min)，即 C 值為 0.1 ～0.2 μmol/(ml·min)。由公式計(jì)算 FXA 效價(jià)，重復(fù)測(cè)定 3 次，取平均值[8]。

t：測(cè)定時(shí)間（min）；Vt：反應(yīng)總體積（ml）；10.4：對(duì)硝基苯胺摩爾吸光系數(shù)[ml/(μmol·cm)]；1：光程（cm）；Vs：FXA 供試品體積（ml）；n：FXA 供試品稀釋倍數(shù)；ΔA=A3–A0。

1.2.2 FXA 單位定義 37 ℃，pH 8.0 條件下，1 min 內(nèi)生成 1 μmol 對(duì)硝基苯胺需要的酶量定義為 1 單位的FXA[9]。

1.2.3 方法驗(yàn)證

1.2.3.1 范圍 測(cè)定不同濃度的 FXA，確定對(duì)硝基苯胺濃度的可測(cè)量范圍。

1.2.3.2 重復(fù)性 在測(cè)量范圍內(nèi)，重復(fù) 6 次測(cè)定同一批次FXA 活性。

1.2.3.3 中間精密度 在測(cè)量范圍內(nèi)，不同人員不同日期測(cè)定同一批次 FXA 活性。

1.2.3.4 耐用性 在測(cè)量范圍內(nèi)，分別采用不同廠家反應(yīng)底物凝血因子 X（FX）、不同廠家生色底物（S-2765）、不同廠家紫外分光光度儀測(cè)定同一批次 FXA 活性。

1.2.3.5 回收率（準(zhǔn)確性） 在測(cè)量范圍內(nèi)，測(cè)定供試品FXA 不同濃度的吸收值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算曲線線性及理論效價(jià)，實(shí)測(cè)效價(jià)與理論效價(jià)比值為回收率。

1.2.3.6 穩(wěn)定性 在測(cè)量范圍內(nèi)，測(cè)定 3 批次 FXA 活性，計(jì)算比活力。

表 1 FXA 測(cè)量范圍確定結(jié)果

圖 1 供試品稀釋倍數(shù)的倒數(shù)與對(duì)硝基苯胺濃度的線性關(guān)系

表 2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表 3 精密度結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 范圍考察

供試品 150107 選擇 6 個(gè)稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)硝基苯胺的濃度范圍確定結(jié)果如表 1 所示，近而限定 FXA 的最佳工作濃度范圍。以供試品稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)硝基苯胺濃度為縱坐標(biāo)，繪制曲線，結(jié)果見圖 1。

由表 1 數(shù)據(jù)可以得出，將 FXA 稀釋適宜濃度使生成的對(duì)硝基苯胺濃度在 0.042 ～ 0.274 μmol/(ml·min) 范圍內(nèi)，F(xiàn)XA 的效價(jià)穩(wěn)定。范圍線性方程為 y = 856.61x + 0.00162，r2= 0.99118，供試品稀釋倍數(shù)的倒數(shù)與對(duì)硝基苯胺濃度線性關(guān)系良好?？紤] FXA 供試品稀釋的適宜性，確定使生成的對(duì)硝基苯胺濃度在 0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內(nèi)。

2.2 重復(fù)性

取供試品 150107 適宜稀釋，使對(duì)硝基苯胺濃度在0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內(nèi)，重復(fù)稀釋測(cè)試 6 次，150107 的效價(jià)平均值為 875 U/ml，重復(fù)性 RSD 為 2.1%，結(jié)果見表 2。

2.3 中間精密度

取供試品 150107 適宜稀釋，使對(duì)硝基苯胺濃度在0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內(nèi)，不同人員不同時(shí)間進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見表 3。150107 的效價(jià)平均值為 906 U/ml，精密度 RSD 為 2.8%。

2.4 耐用性

2.4.1 不同廠家 FX 測(cè)定 FXA 效價(jià)穩(wěn)定性 取供試品 150107 適宜稀釋，使對(duì)硝基苯胺濃度在 0.1 ～0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內(nèi)，用不同廠家反應(yīng)底物 FX 測(cè)定，結(jié)果見表 4。不同廠家的 FX 測(cè)試供試品效價(jià)分別為869 U/ml 和 771 U/ml，RSD 為 6.8%。

2.4.2 不同廠家 S-2765 測(cè)定 FXA 效價(jià)穩(wěn)定性 取供試品 150107 適宜稀釋，使對(duì)硝基苯胺濃度在 0.1 ～0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內(nèi)，用不同廠家生色底物 S-2765測(cè)定效價(jià)，結(jié)果見表 5。不同廠家的 S-2765 測(cè)試供試品效價(jià)分別為 876 U/ml 和 860 U/ml，RSD 為 2.2%。

表 4 不同廠家 FX 測(cè)定結(jié)果

表 5 不同廠家 S-2765 測(cè)定結(jié)果

表 6 不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果

表 7 線性及回收率結(jié)果

圖 2 對(duì)硝基苯胺的線性曲線

表 8 3 批 FXA 的測(cè)定結(jié)果

2.4.3 不同型號(hào)儀器測(cè)定 FXA 效價(jià)穩(wěn)定性 取供試品 150107 適宜稀釋，使對(duì)硝基苯胺濃度在 0.1 ～0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內(nèi)，用不同型號(hào)紫外分光光度計(jì)測(cè)定效價(jià)，結(jié)果見表 6。不同型號(hào)的儀器測(cè)試供試品效價(jià)分別為 869 和 897 U/ml，RSD 為 2.6%。

2.5 回收率

取供試品 150107 適宜稀釋，使對(duì)硝基苯胺濃度在0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內(nèi)，分別稀釋 8333 倍、7143 倍、6250 倍、5000 倍、4000 倍，結(jié)果如表 7。以供試品稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)硝基苯胺濃度為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果見圖 2。線性方程為 y = 848.13x + 0.001282，r2= 0.99356。將稀釋倍數(shù)倒數(shù)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算理論效價(jià)，實(shí)測(cè)效價(jià)與理論效價(jià)比值為回收率，回收率平均值為100.2%，RSD 為 2.6%。

2.6 3 批 FXA 效價(jià)測(cè)定

取供試品 150107、150203、150406 分別適宜稀釋，使對(duì)硝基苯胺濃度在 0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內(nèi)，測(cè)定效價(jià)，結(jié)果見表 8。3 批供試品比活力均在 5500 U/mg左右。

3 討論

3.1 溫控紫外分光光度儀測(cè)定 FXA 效價(jià)方法的反應(yīng)機(jī)制

FXA 水解 FX 生成 FXa，F(xiàn)Xa 水解生色底物（S-2765）生成游離對(duì)硝基苯胺，呈黃色，在 λ = 405 nm 下有最大吸收。如果底物濃度足夠大，能夠使酶的活性中心全部飽和，則反應(yīng)速度與底物濃度無關(guān)，而與酶活性中心的濃度成正比，在 FX 與 S-2765 均足量的條件下，對(duì)硝基苯胺的生成量與 FXA 的含量成正相關(guān)。37 ℃ 條件下，1 min 內(nèi)生成 1 μmol 對(duì)硝基苯胺所需的酶量定義為 1 單位的 FXA。

3.2 溫控紫外分光光度儀測(cè)定 FXA 效價(jià)方法的特點(diǎn)

20 世紀(jì) 80 年代初普遍應(yīng)用的天然底物法以血漿為底物，需目測(cè)判斷血漿凝固時(shí)間，受檢測(cè)者主觀干擾，并且不同廠家的人質(zhì)控血漿和普通人枸櫞酸血漿 FX 含量差異較大，從而導(dǎo)致 FXA 效價(jià)測(cè)試結(jié)果不一致。因此，近二十年文獻(xiàn)多采用更加靈敏、可靠、穩(wěn)定的生色底物法對(duì) FXA進(jìn)行檢測(cè)[10]，生色底物法又分為二步法和 FXA 外標(biāo)法。二步法需要引入 FXa 標(biāo)準(zhǔn)品，不能排除在活化的早期階段和FXa 生成量之間可能存在的非線性關(guān)系，因而不能精確地反映 FXA 的活性作用特點(diǎn)[11]。FXA 外標(biāo)法需提供 FXA標(biāo)準(zhǔn)品，而 FXA 標(biāo)準(zhǔn)品又以血漿為底物目測(cè)方法標(biāo)定，同樣會(huì)出現(xiàn)測(cè)試結(jié)果不穩(wěn)定的問題。

本方法不用 FXA 和 FXa 標(biāo)準(zhǔn)品間接計(jì)算待測(cè)品效價(jià)，用單位時(shí)間內(nèi)對(duì)硝基苯胺生成量定義 FXA 活性單位，減少測(cè)試過程中誤差。在 0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內(nèi)，供試品稀釋倍數(shù)的倒數(shù)與對(duì)硝基苯胺濃度線性關(guān)系良好（r2≥ 0.99），從而驗(yàn)證方法中選擇的反應(yīng)底物 FX 濃度足量。檢測(cè)過程中記錄 0、1、2、3 min 的吸收值（405 nm），從而可驗(yàn)證反應(yīng)中生色底物 S-2765 是否足量。在線性范圍和 3 min 內(nèi)滿足底物 FX 和 S-2765 均過量條件下，該方法具有較好的線性、重復(fù)性、精密度和耐用性，能夠準(zhǔn)確、穩(wěn)定、方便地測(cè)定 FXA 的效價(jià)。