TIMP-2基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性

張曉興，王家建

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，病死率占總癌癥死亡率的第四位，嚴(yán)重危害婦女的身心健康[1]。人乳頭瘤病毒感染被認(rèn)為是引起宮頸癌的主要原因之一[2]。近年來研究者們熱衷于研究基因多態(tài)性與宮頸癌易感性的研究[3]，以期從基因?qū)用娼忉寣m頸癌的發(fā)病機制?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP-2）是基質(zhì)金屬蛋白（MMP）的天然特異性抑制因子，它能夠與相應(yīng)的基質(zhì)金屬蛋白酶結(jié)合來共同維持基質(zhì)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定與結(jié)構(gòu)完整性[4]，TIMP-2是機體內(nèi)主要的內(nèi)源性抑制劑。本研究采用病例-對照的研究方法，通過Mass ARRAY基因分型的方法檢測 TIMP-2基因上的多態(tài)性位點，通過統(tǒng)計學(xué)相關(guān)方法分析其位點多態(tài)性與宮頸癌患病風(fēng)險之間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年6月至2016年8月浙江省湖州市婦幼保健院婦產(chǎn)科收治的宮頸癌患者280例為病例組，入選條件：（1）所有患者均經(jīng)臨床診斷確診為宮頸癌患者；（2）未經(jīng)過放射治療和化學(xué)治療；（3）精神狀況良好；（4）研究對象之間無直接親屬關(guān)系。對照組為年齡、性別及種族匹配的同時期在本院檢驗科進行體檢的300例健康人群，入選條件：（1）既往無腫瘤病史、慢性疾病、嚴(yán)重代謝性疾病及內(nèi)分泌失調(diào)等；（2）精神狀況良好；（3）研究對象之間無直接親屬關(guān)系。本研究已獲得所有研究對象的知情同意，符合倫理學(xué)的各項規(guī)定。

1.2 試劑與儀器 全血基因組純化試劑盒（美國Thermo Fisher公司），iPLEX Gold試劑盒（美國Sequenom公司）；MassARRAY質(zhì)譜儀（美國Sequenom公司），GeneAmp9700 PCR儀（美國ABI公司）。

1.3 血樣采集及DNA提取 采集每位研究對象外周靜脈血5ml，置于EDTA抗凝管中，現(xiàn)場編號并登記姓名，所有標(biāo)本采集當(dāng)天送回實驗室，置于―70℃冰箱保存，以備DNA提取。采用全血DNA純化試劑盒進行DNA提取，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進行。

1.4 基因分型 從NCBI和HapMap數(shù)據(jù)庫中查詢TIMP-2基因的多態(tài)性位點，選擇在CHB人群最小等位基因頻率≥5%的位點，最終確定了TIMP-2基因上的TIMP-2-418G/C和TIMP-2+853G/Al兩個多態(tài)性位點作為本研究中的研究位點。選擇單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，采用Sequenom MassARRAY SNP基因分型技術(shù)對其進行分型。單堿基延伸引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進行設(shè)計和合成。反應(yīng)在MassArray質(zhì)譜儀中進行，基因分型使用Sequenom MassARRAY RS1000軟件進行。

1.5 統(tǒng)計方法 應(yīng)用 SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用精確檢驗對對照組進行Hardy-Weinberg平衡（HWE）檢驗，評估對照組的可靠性。計算各位點的等位基因及基因型頻數(shù)，采用2檢驗比較兩組間各位點的等位基因頻率分布差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義，初步確定檢測的位點是否與宮頸癌患病風(fēng)險相關(guān)。應(yīng)用 SNP Stats在線軟件（http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm）測定各個 SNP位點基因型與宮頸癌患病風(fēng)險。以相對優(yōu)勢比（）和95%可信區(qū)間（）來評估SNP與宮頸癌患病風(fēng)險的關(guān)系。＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果TIMP-2-418G/C和TIMP-2+853G/A多態(tài)性位點的基因型及等位基因頻率分布如表1和表2所示。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗，發(fā)現(xiàn)病例組和對照組人群的基因型頻率分布均符合該定律（＞0.05），說明選擇的樣本具有代表性。

2.2 TIMP-2基因多態(tài)性位點的基因型及等位基因頻率分布 TIMP-2-418G/C多態(tài)性位點的等位基因頻率分布在病例組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05），而基因型頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（2＝12.028=0.002）；TIMP2+853A/G 位點的基因型和等位基因頻率分布在病例組和對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均＜0.01），且病例組等位基因G頻率分布明顯高于對照組。見表1～2。

2.3 TIMP-2基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)分析 在等位基因模型下，TIMP-2-418G/C多態(tài)性與宮頸癌的患病風(fēng)險均不存在相關(guān)性（均＞0.05）；等位基因模型下，TIMP-2+853G/A多態(tài)性位點的G等位基因與宮頸癌存在相關(guān)性（＜0.05），C等位基因與宮頸癌的患病風(fēng)險不存在相關(guān)性（＞ 0.05）。見表3。

2.4 TIMP-2基因多態(tài)性位點在不同遺傳模型下與宮頸癌的相關(guān)性分析 通過無條件邏輯回歸模型，引入三種遺傳模型（顯性、隱性和加性），分別計算各位點等位基因的和95%，衡量各位點風(fēng)險等位基因?qū)m頸癌患病風(fēng)險的效應(yīng)大小，并按照性別、年齡修正。結(jié)果顯示在顯性模型下，TIMP-2+853G/A多態(tài)性位點的最小等位基因G與增加宮頸癌患病風(fēng)險具有相關(guān)性（=0.045）；TIMP-2－418G/C多態(tài)性位點在三種遺傳模型下都與宮頸癌的患病風(fēng)險無關(guān)（＞0.05）。見表4。

3 討論

表1 TIMP-2基因-418位點基因型頻率及等位基因頻率分布 例（%）

表2 TIMP-2基因+853位點基因型頻率及等位基因頻率分布 例（%）

表3 TIMP-2基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián) 例（%）

本研究通過病例-對照的研究設(shè)計，利用Mass ARRAY技術(shù)檢測TIMP-2基因的TIMP-2-418G/C與TIMP-2+853G/A多態(tài)性位點，并分析該基因的多態(tài)性位點與宮頸癌患病風(fēng)險的相關(guān)性。結(jié)果顯示：TIMP2+853A/G多態(tài)性位點的基因型和等位基因頻率分布在病例組和對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，病例組等位基因G頻率分布明顯高于對照組，顯著增加宮頸癌的患病風(fēng)險（=0.045）。通過各位點的基因型頻率比較發(fā)現(xiàn)TIMP-2+853G/A多態(tài)性位點的G/G基因型頻率在病例和對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，能顯著增加宮頸癌的患病風(fēng)險（=0.035）。此外，研究中沒有發(fā)現(xiàn)TIMP-2-418G/C多態(tài)性位點與宮頸癌的患病風(fēng)險之間的相關(guān)性（＞ 0.05）。

TIMPs（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和 TIMP-4）是MMPs主要的天然內(nèi)源性抑制劑，TIMP-2可以抑制任意一種MMPs特異性結(jié)合，是一種相對分子量為21kd的非糖基化蛋白,含有192個氨基酸[5]。近年來，許多關(guān)于基因調(diào)控的實驗進一步證實了MMPs與TIMPs比例失衡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起重要作用[6]。有研究表明 TIMP2分子在宮頸癌組織中的表達(dá)與組織分化程度和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-8]。本研究結(jié)果顯示TIMP2+853A/G多態(tài)性位點的基因型和等位基因頻率在病例組和對照組的分布具有顯著性差異，能顯著增加宮頸癌的患病風(fēng)險（=2.35，95%1.24～ 3.15=0.035）。

綜上所述，本研究結(jié)果表明TIMP-2基因多態(tài)性與宮頸癌患病風(fēng)險之間存在相關(guān)性，表明TIMP-2基因多態(tài)性在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起著重要的作用。雖然本研究發(fā)現(xiàn)了TIMP-2基因上與宮頸癌患病風(fēng)險相關(guān)的多態(tài)性位點，但本研究樣本量相對較少。因此，在后續(xù)的研究中我們?nèi)匀恍枰M一步在大量人群中去驗證這些多態(tài)性位點及其與宮頸癌患病風(fēng)險的相關(guān)性；而且沒有進行候選SNP位點的功能學(xué)研究，所以在后續(xù)的研究中還需用功能實驗證候選基因與宮頸癌的相關(guān)性；最后，也需要在不同的人群中去驗證這些多態(tài)性位點，以期為宮頸癌的臨床診斷及治療提供依據(jù)。

表4 各個遺傳模型下候選SNP對宮頸癌患病的風(fēng)險系數(shù)