不同恒溫培養(yǎng)設(shè)備對利普斯E50牛奶抗生素殘留檢測試劑檢測結(jié)果的影響試驗(yàn)

崔晨光

(河北 省行唐縣畜牧工作總站,河北 行唐 050600)

當(dāng)前，隨著人民生活水平的日益提高，對牛奶產(chǎn)品的需求量不斷增加，促進(jìn)了奶牛養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；目焖侔l(fā)展，鮮牛奶及鮮奶制品已成為人們生活必不可少的食品之一。在奶牛養(yǎng)殖過程中，對奶牛疾病的治療離不開抗生素的使用，經(jīng)常被用來治療奶牛的各種感染性疾病,而抗生素在代謝過程中殘留于牛奶當(dāng)中,如果人們飲用含抗生素殘留的牛奶及其制品,也就相當(dāng)于低劑量的吸食抗生素,從而破壞人體內(nèi)的正常機(jī)能,也易造成人對抗生素產(chǎn)生耐藥性等問題，不利于人體健康和今后疾病的治療。因此通過加強(qiáng)對牛奶中的抗生素進(jìn)行檢測，拒收抗生素奶成為當(dāng)前的重中之重。行唐縣作為奶牛養(yǎng)殖大縣，基層奶站在生鮮乳抗生素殘留快速檢測過程中常用的為利普斯E50牛奶抗生素殘留檢測試劑，該試劑制造商為西班牙ZEU-INMUNOTEC,S.L.。是國內(nèi)乳品企業(yè)推薦基層奶站使用的牛奶廣譜檢測方法，可檢測到β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、氯霉素、林可酰胺類等抗生素，其特點(diǎn)是快速，安全和精確，無需樣品前處理，只需一步操作，穩(wěn)定。原理是基于細(xì)菌生長抑制的原理，該試劑盒包括一塊微孔板，每個(gè)微孔注有分布了嗜熱芽孢桿菌的瓊脂培養(yǎng)基和 pH 指示劑。當(dāng)在65℃下培養(yǎng)微孔板時(shí)，孢子發(fā)育生長，進(jìn)而降低了培養(yǎng)基的pH 值，在pH 指示劑的作用下，原來的藍(lán)(紫)色將會變?yōu)榫G-黃色。如果牛奶中的抗生素濃度高于的檢測限，微生物的生長和酸的生產(chǎn)將會受到抑制，由于沒有酸生成，瓊脂中的顏色將不會改變。基層奶站在檢測過程中，由于各個(gè)奶站配備的恒溫培養(yǎng)設(shè)備不同，有時(shí)檢測結(jié)果出現(xiàn)有差異，本試驗(yàn)就是將利普斯E50牛奶抗生素殘留檢測試劑運(yùn)用基層配備的具有代表性的三種不同的恒溫培養(yǎng)設(shè)備進(jìn)行檢測，并讀取結(jié)果，以驗(yàn)證其在是否存在檢測結(jié)果的誤差，并根據(jù)結(jié)果來總結(jié)經(jīng)驗(yàn)體會。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

(1)“Eclipse 50 plate”利普斯E50牛奶抗生素殘留檢測試劑，由上海千慕生物科技有限公司提供。批號：17112102-023；規(guī)格：96次/板；冷藏避光保存(4～12)℃。對于青霉素G檢出限為2～4 ppb。

(2)三元純牛奶250 mL/盒，隨機(jī)抽取奶罐純牛奶樣品200 mL

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

K30電熱恒溫孵育器1臺、wp25型電熱恒溫培養(yǎng)箱1臺、DK-98-11A型電熱恒溫水浴鍋一臺、20～200 μL微量移液器一把，槍頭若干。

2 樣品制備

陽性樣品：在三元純牛奶添加濃度為10 ppb的青霉素G抗生素。

陰性樣品：三元純牛奶。

參照樣品：奶罐純牛奶

3 試驗(yàn)方法

用裁紙刀或剪子沿微孔外側(cè)劃開金屬薄膜。注意不要剪開剩余的微孔板上的金屬薄膜，因?yàn)檫@會使微孔揮發(fā)導(dǎo)致培養(yǎng)基變干。從塑料框上取下已剪開的微孔條。只需簡單地用指尖向上壓微孔條，微孔條即可分離出來。剩余的微孔板需立即放回塑料袋中密封在4～8℃下冷藏儲存。共需取出18個(gè)微孔，將要使用的微孔板安放到另一個(gè)空的白色塑料架上，分成三組，每組6個(gè)微孔，剝開微孔上的膠粘金屬膜，在每個(gè)微孔中加入50 μL牛奶樣品，依次為奶罐純牛奶、陰性樣品、奶罐純牛奶、陽性樣品，需做平行試驗(yàn)，每個(gè)樣品加2個(gè)孔，防止結(jié)果出現(xiàn)偏差。每吸取一個(gè)奶樣更換一個(gè)干凈的吸頭，避免交叉污染。 用膠粘紙小心地密封微孔板(條)，將其垂直放入到已經(jīng)預(yù)熱到65℃的恒溫孵育設(shè)備中。在使用電熱恒溫水浴鍋時(shí)，檢測試劑加好樣品后，封口膜將微孔密封，最好裝進(jìn)自封口塑料袋中封好口，放進(jìn)水浴鍋中，防止水淹沒試劑，造成無效檢測；必須確保微孔已經(jīng)完全密封。如若在培養(yǎng)過程中有水滴落到微孔中，將會產(chǎn)生錯(cuò)誤的檢測結(jié)果。培養(yǎng)時(shí)間按出廠報(bào)告上的時(shí)間培養(yǎng)(一般情況為2時(shí)45分)，也可按照陰性對照樣品變黃為實(shí)驗(yàn)終止時(shí)間，到時(shí)間后從微孔側(cè)面觀察結(jié)果。綠-黃色或者黃色表示抗生素不存在(陰性)，藍(lán)-紫色表示抗生素存 在(陽性)，綠-藍(lán)色表示抗生素濃度接近的檢測限。此時(shí)建議重做檢測。

3 檢測結(jié)果

3.1 利普斯E50牛奶抗生素殘留檢測試劑判定檢測結(jié)果對照圖如下

3.2 試驗(yàn)檢測結(jié)果情況見下圖

由圖中可以看出：

(1)用K30電熱恒溫孵育器對利普斯E50抗生素檢測試劑進(jìn)行恒溫培養(yǎng)2小時(shí)45分后，奶罐純牛奶、陰性樣品、奶罐純牛奶、陽性樣品的檢測結(jié)果分別為陰性、陰性、陰性、陽性。檢測結(jié)果一目了然，非常容易觀察分辨。

(2)wp25型電熱恒溫培養(yǎng)箱對利普斯E50抗生素檢測試劑進(jìn)行恒溫培養(yǎng)2小時(shí)45分后，奶罐純牛奶、陰性樣品、奶罐純牛奶、陽性樣品的檢測結(jié)果分別為疑似、疑似、疑似、陽性。陰性樣品退色不是太明顯，檢測結(jié)果不是太容易觀察分辨，如沒有陰性對照，容易誤判為陽性。繼續(xù)培養(yǎng)20分鐘后，陰性樣品變?yōu)辄S色。

(3)DK-98-11A型電熱恒溫水浴鍋對利普斯E50抗生素檢測試劑進(jìn)行恒溫培養(yǎng)2小時(shí)45分后，奶罐純牛奶、陰性樣品、奶罐純牛奶、陽性樣品的檢測結(jié)果分別為陰性、陰性、陰性、陽性。檢測結(jié)果一目了然，非常容易觀察分辨。

4 結(jié)論

由試驗(yàn)結(jié)果可以看出利普斯E50牛奶抗生素殘留檢測試劑對牛奶抗生素進(jìn)行快速檢測時(shí)，不同的恒溫培養(yǎng)設(shè)備之間的檢測結(jié)果是有誤差存在的，K30電熱恒溫孵育器和DK-98-11A型電熱恒溫水浴鍋相對于電熱恒溫培養(yǎng)箱的檢測結(jié)果更加穩(wěn)定。

5 注意事項(xiàng)

(1)由于利普斯E50牛奶抗生素殘留檢測試劑對于抗菌物質(zhì)極其敏感(抗生素，磺胺類藥物以及其它的消毒劑、清洗劑等)，因此應(yīng)在檢測過程中避免與該類物質(zhì)接觸，在開始檢測前應(yīng)徹底清洗雙手，在干凈的臺面進(jìn)行檢測。否則容易出現(xiàn)假陽性，影響檢測結(jié)果。

(2)利普斯E50牛奶抗生素殘留檢測試劑對牛奶抗生素進(jìn)行快速檢測時(shí)，選用恒溫培養(yǎng)的設(shè)備，溫度必須嚴(yán)格控制在65℃±1℃，超過此溫度條件，檢測結(jié)果會受到影響，嚴(yán)重的就會有假陽性和假陰性結(jié)果出現(xiàn)。筆者推薦使用干式恒溫孵育器(如：K30電熱恒溫孵育器)，該機(jī)器恒溫相對于其他恒溫設(shè)備比較穩(wěn)定，升溫快，溫控較好，不會出現(xiàn)過多的溫度波動(dòng)。使用電熱恒溫水浴鍋或電熱恒溫培養(yǎng)箱時(shí)，在溫度恒定65℃以后，隨時(shí)注意觀察溫度，可用溫度計(jì)監(jiān)控一下，看溫度偏差是否在±1℃以內(nèi)。應(yīng)注意溫度嚴(yán)格必須控制在65℃±1℃，在使用電熱恒溫水浴鍋過程中，檢測試劑加好樣品后，封口膜將微孔密封，最好裝進(jìn)自封口塑料袋中封好口，放進(jìn)水浴鍋中，防止水淹沒試劑，造成無效檢測；電熱恒溫培養(yǎng)箱因?yàn)殚_關(guān)箱門易造成溫度大幅變動(dòng)，因此可適當(dāng)增加培養(yǎng)時(shí)間，不局限于3個(gè)小時(shí)，同時(shí)隨時(shí)注意觀察溫度是否正常，可按照陰性樣品變成黃色的時(shí)間為終止試驗(yàn)的時(shí)間。

(3)在試驗(yàn)過程中一定要加陰性和陽性樣品作為對照，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。