從肉牛脂肪組織中提取總RNA技術(shù)方法的改進(jìn)

李 娜，余群力，李紅波，閆向民，張金山，袁理星，杜 瑋，崔繁榮，葉治兵，張 楊*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，蘭州 730000；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830000)

RNA提取技術(shù)是現(xiàn)代分子生物技術(shù)中一種常用技術(shù)，也是做好功能基因組學(xué)技術(shù)的第一步。其產(chǎn)量、純度決定了分子克隆和基因表達(dá)等研究數(shù)據(jù)的可靠性[1]。提取總RNA對(duì)Northern印跡及雜交分析以及主要由脂肪組織分泌合成的基因表達(dá)情況的試驗(yàn)是至關(guān)重要的。到目前為止，已有大量利用各種和商業(yè)化試劑成功提出高質(zhì)量RNA的文獻(xiàn)[1]。由于組織特異性，某些特殊組織中總RNA的豐度極低(如脂肪，腦、骨骼肌等)，按照常規(guī)或是試劑說明書的通用步驟不能得到高質(zhì)量的RNA。在做基因RT-PCR定性分析過程中，很難進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而阻礙研究的進(jìn)展。因此本文以脂肪組織為材料，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，在試劑公司提供的RNA提取操作步驟基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)。得到符合試驗(yàn)要求高質(zhì)量的RNA。并利用改進(jìn)后方法提取肉牛肌間、皮下、腎周和心周脂肪各組織中總RNA，進(jìn)行了瘦素基因(Lep)在以上四個(gè)部位脂肪組織中的表達(dá)差異性研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品采集

參照張寧的方法進(jìn)行采集脂肪樣品(肌間脂肪、腎周脂肪、皮下脂肪、心周脂肪)300 g/樣品立即投入液氮速凍，貼好標(biāo)簽、保存液氮中。

1.2 主要儀器、試劑及PCR引物

1.2.1 主要儀器及試劑 Light Cycler 2.0熒光定量PCR儀；紫外分光光度計(jì)；TRIzol? Total RNA Reagent 總RNA提取試劑。

1.2.2 PCR引物 Gapdh內(nèi)參對(duì)照上游引物：5＇TCATAGACAAGATGGTGAAGGTC3，，下游引物：5＇AGACACCGTGAAAAGGAGA 3＇產(chǎn)物長度163 bp；牛Lep基因上游引物：5＇TCATAGACAAGATGGTGAAGGTC 3，，下游引物：5，CACTGAATGTTTGTGGAATG 3＇產(chǎn)物長度207 bp；引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 總RNA的提取

按照TRIzol試劑說明書進(jìn)行脂肪組織總RNA的提取，由于肌間脂肪、腎周脂肪、皮下脂肪、心周脂肪等脂肪組織含有大量的油脂，而且RNA的豐度極低，所得含量極少。因此，特別對(duì)試驗(yàn)部分操作步驟做了相應(yīng)的優(yōu)化與改進(jìn)，希望從中獲得較高質(zhì)量的總RNA。TRIzol試劑說明書操作步驟優(yōu)化與改進(jìn)關(guān)鍵點(diǎn)如下圖所示：

其TRIzol試劑說明書操作步驟優(yōu)化與改進(jìn)關(guān)鍵點(diǎn)

(1)加大樣品量，在離心管中加入少許液氮，依次加入樣品充分混勻，延長靜置時(shí)間，使細(xì)胞完全裂解；

(2)萃取時(shí)將粘在離心管的脂肪取出，取得的下層溶液需做同樣的二次離心，以保證完全去除脂類污染。將兩個(gè)平行樣吸取上層水相，都置同一個(gè)新的離心管中解決提取過程中RNA濃度低的問題；

(3)沉淀RNA時(shí)，輕搖混勻、冰上放置、縮短靜止時(shí)間減少降低RNA降解；

(4)洗滌去除DNA時(shí)，75%的乙醇必須用特制水配制可抑制RNA酶，延長RNA保存時(shí)間，此步驟重復(fù)一次可有效除去基因組DNA污染。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪組織總RNA瓊脂糖電泳

為進(jìn)一步檢測所提取總RNA的質(zhì)量，用1%甲醛變性膠電泳檢測，120V，15 min，UV凝膠成像儀下照相(圖1、2、3)。

圖1 按說明書所提肌肉中的RNA的電泳結(jié)果 圖2 按說明書所提的脂肪中RNA的電泳結(jié)果

由圖1可知，按照TRIzol說明書操作方法提取肌肉中的RNA條帶比較清晰，說明完整性好，得率高。但是圖2中按照說明書操作方法提取脂肪組織中的RNA有基因組DNA污染，28S與18S的rRNA帶不清楚得到的RNA純度及濃度無法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。由圖3可知經(jīng)過對(duì)操作方法改進(jìn)后，脂肪組織中RNA制品沒有受到基因組DNA污染，條帶比較清晰，28S和18S的rRNA亮度比值約為2/1，表明RNA制品純度高且完整性好產(chǎn)量高。

圖3 TRIzol操作方法改進(jìn)后所提的RNA的電泳結(jié)果

2.2 操作方法改進(jìn)前后RNA的純度和得率比較

用紫外分光光度計(jì)分別檢測脂肪及肌肉樣品中提取的RNA 純度及得率，用Graphpad prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表1：

表1 提RNA操作方法改進(jìn)前后的純度和得率比較

注：同列數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，不同大寫字母的表示差異極顯著P<0.01。

由表1可知，改進(jìn)后脂肪組織中的RNA與未改進(jìn)肌肉組織中的RNA的純度差異不顯著，但得率差極顯著(P<0.01)，與未改進(jìn)脂肪組織中的RNA的純度、得率差異極顯著(P<0.01)。

2.3 試驗(yàn)成本比較分析

RNA提取已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物學(xué)一項(xiàng)很成熟的技術(shù)，但由于RNase酶非常穩(wěn)定不易滅活，很難在實(shí)際研究中獲得高質(zhì)量的RNA[2-3]。目前，成本價(jià)為1600元/100次的TRIzol試劑可提取各種組織中RNA，經(jīng)對(duì)部分步驟進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化后，可提取RNA含量少的脂肪組織中的RNA，其提取的RNA純度和濃度完全可以滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求，與成本價(jià)約為3 000～5 000元/100次脂肪組織總RNA的試劑盒相比，體現(xiàn)成本低廉，并能取得理想的試驗(yàn)效果。

綜上所述，通過TRIzol方法部分步驟改進(jìn)和優(yōu)化后，試驗(yàn)結(jié)果得到了符合后續(xù)試驗(yàn)要求的高質(zhì)量RNA，同時(shí)該方法所用試劑價(jià)格低廉，完全可以替代價(jià)格昂貴的試劑盒進(jìn)行脂肪組織中總RNA的提取。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)需要選擇適合試驗(yàn)條件和要求的運(yùn)用此方法。

2.4 開展Lep基因的在不同脂肪組織中的表達(dá)差異

在伊犁西天山農(nóng)牧發(fā)展有限責(zé)任公司隨機(jī)選取舍飼條件下、年齡、營養(yǎng)條件均一致的成年新疆褐牛公牛20頭，屠宰后并采集脂肪樣品(肌間脂肪、腎周脂肪、皮下脂肪、心周脂肪)立即投入液氮速凍，貼好標(biāo)簽、保存液氮中開展Lep基因在不同脂肪組織中表達(dá)差異的研究。

按照改進(jìn)后的方法，分別從肌間、皮下、腎周、心周脂肪組織中提取并純化獲得高質(zhì)量的RNA，以Lep、Gapdh為引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。本試驗(yàn)以肌間脂肪為參照，采用Graphpad prism統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)不同部位Lep基因表達(dá)差異性進(jìn)行研究。反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4、表2。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，Lep基因在新疆褐牛不同部位脂肪組織中的表達(dá)量是不同的。Lep在肌間脂肪組織表達(dá)量極顯著高于腎周、皮下脂肪組織(P<0.01)如：表2、圖5。

M：D2000 marker；1、2、3、4、6：RT-PCR產(chǎn)物

表2 Lep基因在不同脂肪組織的表達(dá)水平

以肌間為對(duì)照同行數(shù)據(jù)間進(jìn)行單因子方差分析， *表示P<0.05差異顯著，**表示P<0.01差異極顯著。

圖5 Lep基因在不同脂肪組織中的表達(dá)水平

3 討論

成年動(dòng)物的脂肪組織單位體積細(xì)胞數(shù)量與其他組織相比較少，脂質(zhì)含量豐富[4-5]，因而每毫克組織樣品所含總RNA的量小于0.05μg，若增加組織塊的量，造成總RNA得率較低。當(dāng)RNA的量很少時(shí)，不僅造成電泳時(shí)極有可能看不見條帶，就不知道其是否完整，也就不能通過觀測RNA的完整性來推測mRNA是否降解。而且使RNA反轉(zhuǎn)錄的DNA的濃度低，熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差。按照試劑公司說明書提取脂肪組織中RNA效果不理想。本研究以脂肪組織為材料，在總RNA提取試劑盒說明書操作步驟基礎(chǔ)上，優(yōu)化和改進(jìn)提取過程中的一些步驟，對(duì)脂肪組織進(jìn)行提取前處理、縮短了RNA沉淀時(shí)間，有效除脂，改變了靜止方式有效的減少RNA降解。得到了符合試驗(yàn)要求的高質(zhì)量、高純度的總RNA。不僅能用于脂肪組織，也可以用于RNA得率較低的組織如：心臟、骨骼肌等纖維組織或腦等富含脂肪較多的組織。

Lep在成熟的脂肪細(xì)胞中，可以直接促進(jìn)甘油三酯的分解，降低脂肪合成[6-8]。利用改進(jìn)后的RNA提取方法，成功的提取新疆褐牛肌間、皮下、腎周、心周脂肪組織中高質(zhì)量RNA，經(jīng)相對(duì)定量PCR反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，Lep在四個(gè)部位都有表達(dá)，但在肌間脂肪組織表達(dá)量極顯著高于在其他脂肪組織中的表達(dá)水平，表明Lep基因表達(dá)具有組織特異性。

4 結(jié)論

本研究通過優(yōu)化和改進(jìn)提取步驟，對(duì)RNA含量少的脂肪組織有效除脂，減少了RNA降解，降低提取成本，得到了符合試驗(yàn)要求的高質(zhì)量的RNA。在后續(xù)新疆褐牛脂代謝調(diào)控Lep基因在不同部位脂肪組織中表達(dá)試驗(yàn)中得到了可靠的數(shù)據(jù)。為今后RNA定量或定性試驗(yàn)以及新疆褐牛肉用新類型選育提供技術(shù)支撐。