• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    不同測(cè)序技術(shù)在結(jié)節(jié)性硬化相關(guān)腎血管平滑肌脂肪瘤基因診斷中的應(yīng)用

    2018-08-13 07:44:08郭剛王威朱捷祖強(qiáng)張旭
    微創(chuàng)泌尿外科雜志 2018年4期
    關(guān)鍵詞:錯(cuò)義高通量外顯子

    郭剛 王威 朱捷 祖強(qiáng) 張旭

    1中國人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科 100853 北京

    結(jié)節(jié)性硬化癥(tuberous sclerosis complex, TSC)是一組常染色體顯性遺傳并累及三個(gè)胚層多種器官的綜合征,其在新生兒的發(fā)病率約為1/5 800,總患病率約為1/12 500。其主要由TSC1和TSC2基因失活性突變所致,特征性臨床表現(xiàn)為面部血管纖維瘤、癲癇、智力低下三聯(lián)征,病變隨年齡增長逐漸進(jìn)展[1]。文獻(xiàn)報(bào)道,約10%的腎臟血管平滑肌脂肪瘤(angiomyolipoma, AML)患者合并有TSC,而TSC患者中超過80%合并有腎臟AML。與散發(fā)性腎臟AML,TSC相關(guān)的腎臟AML多表現(xiàn)為雙側(cè)多發(fā),易出現(xiàn)出血、腎衰竭等嚴(yán)重后果[2]。2012版國際TSC專家共識(shí)給出的TSC診斷標(biāo)準(zhǔn)包括臨床診斷和基因診斷兩部分,并將基因診斷作為獨(dú)立的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。既往的一代測(cè)序技術(shù)雖然費(fèi)用低廉,但一部分突變無法檢出,也無法明確所檢測(cè)到的突變是否具有致病性[4]。我們對(duì)47例臨床診斷為TSC相關(guān)AML的患者和32例散發(fā)性腎AML患者應(yīng)用一代測(cè)序PCR-SSCP和目標(biāo)序列捕獲二代測(cè)序技術(shù)(NGS)進(jìn)行TSC1/2基因突變檢測(cè),對(duì)比兩者在基因診斷中的應(yīng)用價(jià)值,現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料

    納入2015年1月~2017年6月在我院臨床診斷為結(jié)節(jié)性硬化相關(guān)AML患者共47例作為研究對(duì)象,其中男11例,女36例,平均32.1歲(18~50歲)。其中11例患者來自7個(gè)家系。另有32例為散發(fā)性腎血管平滑肌脂肪瘤,其中男12例,女20例,平均34.2歲(26~53歲)。所有患者均行增強(qiáng)CT或MRI檢查明確腫瘤大小、位置、數(shù)量及主要成分構(gòu)成。所有患者均表現(xiàn)為雙腎多發(fā)血管平滑肌脂肪瘤,瘤體平均最大直徑9.6 cm(4~30 cm),其中有2例患者病理證實(shí)為惡性腎血管周上皮樣細(xì)胞腫瘤。依據(jù)2012版結(jié)節(jié)性硬化臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)記錄患者的一般情況、遺傳信息、既往病史(是否癲癇發(fā)作等)、體格檢查結(jié)果、影像學(xué)檢查及其他輔助檢查結(jié)果,詳見表1。

    1.2 檢測(cè)方法

    1.2.1一代測(cè)序 ①血樣采集:臨床血樣來源于在解放軍總醫(yī)院就診的79例臨床診斷為腎臟AML的患者。采用EDTA抗凝管收集患者外周靜脈血5ml,檢測(cè)前在4°C冰箱內(nèi)保存48 h,血樣采集獲得中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并簽署知情同意書。②基因突變分析:分離外周血白細(xì)胞,按照DNA提取試劑盒(QIAampDNA Blood Midi Kit, Qiagen, 希爾登, 德國)操作說明提取血液基因組DNA 。所有TSC1 和TSC2 的外顯子應(yīng)用相鄰的基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用SSCP法(single-strand conformation polymorphism)進(jìn)行基因突變分析。突變基因采用DNA測(cè)序方法進(jìn)行復(fù)核。共檢測(cè)TSC1基因21個(gè)外顯子和TSC2基因41個(gè)外顯子。記錄所有患者的基因突變發(fā)生情況。

    表1 患者基本信息

    1.2.2目標(biāo)序列捕獲二代測(cè)序 ①目標(biāo)序列捕獲與測(cè)序:抽取受試者及對(duì)照者靜脈血5ml,標(biāo)準(zhǔn)流程提取基因組DNA(QIAamp DNA Blood Midi Kit,Qiagen,Hilden,Germany)。利用Covaris LE220超聲波儀(Massachusetts, USA)將基因組DNA打斷成200~250 bp的片段,隨后進(jìn)行Ampure Beads純化,將純化后的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)、加“A”以及加接頭反應(yīng),從而完成單個(gè)受檢者的DNA建庫。Non-Captured樣品進(jìn)行LM-PCR反應(yīng),純化,利用定制的基因片段捕獲探針 (BGI自主探針), 65℃雜交捕獲24h,雜交結(jié)束后進(jìn)行探針的洗滌和洗脫反應(yīng),隨后進(jìn)行Captured樣品的LM-PCR反應(yīng)。文庫經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer 和 ABI StepOne進(jìn)行片段大小、濃度的檢測(cè),最后利用高通量測(cè)序儀Illumina HiSeq2500 Analyzers(Illumina,SanDiego,USA)連續(xù)雙向測(cè)序90個(gè)循環(huán),用Illumina Pipeline software(version 1.3.4)讀出原始測(cè)序數(shù)據(jù)。②序列分析:數(shù)據(jù)下機(jī)后進(jìn)入信息分析部分。首先對(duì)下機(jī)的原始數(shù)據(jù)(Raw reads)進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估,去除低質(zhì)量以及被接頭污染的讀數(shù)。隨后用BWA軟件(Burrows Wheeler Aligner)與HG19進(jìn)行序列比對(duì),與此同時(shí)進(jìn)行序列捕獲效果評(píng)價(jià),用SOAPsnp軟件和Samtools軟件分別進(jìn)行SNV(single nucletide variant)和Indel(insertion and deletion)的查詢,生成目標(biāo)區(qū)域堿基多態(tài)性結(jié)果,隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(NCBI dbSNP, HapMap, 1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults)的比對(duì),并對(duì)找出的可疑突變進(jìn)行注釋、篩選。③Sanger法驗(yàn)證:對(duì)于所有發(fā)現(xiàn)的致病突變,在其所在片段上下游設(shè)計(jì)引物。進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)產(chǎn)物做Sanger測(cè)序,所得結(jié)果與TSC1/2基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì),從而驗(yàn)證探針捕獲和高通量測(cè)序的結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 一代測(cè)序

    共檢測(cè)TSC1基因21個(gè)外顯子和TSC2基因的41個(gè)外顯子,66例(83.5%)患者檢測(cè)到TSC1或TSC2基因突變,其中TSC1共19例,TSC2共29例,兩者同時(shí)突變18例;其中結(jié)節(jié)性硬化組40例(85.1%) ,散發(fā)組26例(81.3%)檢測(cè)到基因突變(P>0.05)。未檢測(cè)到基因突變13例。具體突變位點(diǎn)包括:TSC1:Exon5/23(各4例),Exon7/13/17/18/22(各3例),Exon15/34/8/12/16(各2例),Exon6/14/19/20(各1例); TSC2:Exon6/17/33/36(各4例),Exon1/4/5(各3例),Exon7/9/11/21/22/23(各2例),Exon3/8/12/13/20/27/28/34/35/38(各1例),詳見表2。

    表2 兩組患者不同基因檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

    2.2 目標(biāo)序列捕獲二代測(cè)序

    BWA軟件行序列捕獲效果評(píng)價(jià)顯示,所有樣本NGS平均堿基覆蓋度為99.88%,最低樣本覆蓋度為99.44%。目標(biāo)區(qū)域平均測(cè)序深度>30X位點(diǎn)所占比例平均值為98.92%,最低值為97.35%。所有樣本的平均測(cè)序深度為280.4X,最低測(cè)序深度為168.4X。而且TSCl和TSC2基因各外顯子上的平均測(cè)序深度與測(cè)序深度中位數(shù)均比較接近,表明目標(biāo)序列捕獲二代測(cè)序的隨機(jī)性較好。

    39例(49.4%)患者檢測(cè)到TSC1或TSC2基因突變,其中TSC1 6例,TSC2 31例,兩者同時(shí)突變2例,其中結(jié)節(jié)性硬化組34例(72.3%),散發(fā)性組5例(15.6%)檢測(cè)到基因突變,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。共鑒定出32種突變,包括5種無義突變,7種框移突變,8種錯(cuò)義突變,4種大片段缺失突變和4種剪接突變,3種點(diǎn)突變,1例插入突變。另有2例患者鑒定出臨床意義未明的非同義突變 ,是分別位于TSCl基因第34號(hào)外顯子的C.26247G>C非同義變和位于TSC1基因引導(dǎo)區(qū)的C.2640G>T非同義突變。此外,還有8例臨床診斷為TSC的患者未能檢測(cè)到TSCl或TSC2基因的任何突變(表3)。87.18%的基因突變均位于TSCl或TSC2基因外顯子區(qū)域,47例患者中總的突變檢出率為72.3%。

    通過對(duì)比以往文獻(xiàn)及LOVD數(shù)據(jù)庫MJ[5],共有4個(gè)臨床意義未明確的突變和2個(gè)未報(bào)道突變。4個(gè)臨床意義未明確突變中:TSC2外顯子18的C.1939G>A錯(cuò)義突變和TSC1外顯子15的C.1700C>T錯(cuò)義突變患者的臨床特征無法確診為TSC;而位于TSC2外顯子30的C.3610G>A錯(cuò)義突變,位于TSC1的C.*1717-55T>C錯(cuò)義突變以及位于TSC2的C.*2626-4delT大片段缺失突變患者為TSC臨床確診病例。而2個(gè)新發(fā)現(xiàn)突變分別位于TSC2基因的C.-29-6G>A剪切突變和位于TSC1外顯子15的C.1916G>T錯(cuò)義突變,兩名患者的臨床特征均未能確診為TSC。

    2.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證

    應(yīng)用常規(guī)Sanger測(cè)序?qū)?3例NGS檢測(cè)到30種突變位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,其結(jié)果與目標(biāo)序列捕獲測(cè)序結(jié)果完全一致,符合率100%。此外,對(duì)于4例大片段基因缺失的患者。采用定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果與NGS一致。

    3 討論

    TSC是以錯(cuò)構(gòu)瘤為主要表現(xiàn)的累及多個(gè)系統(tǒng)和器官的常染色體顯性遺傳性疾病,TSC1和TSC2兩個(gè)腫瘤抑制基因是該病的致病基因。TSC1基因含有23個(gè)外顯子,第1、2外顯子不具有編碼功能,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為相對(duì)分子質(zhì)量為8.6的mRNA,編碼相對(duì)分子質(zhì)量為1.3×105,由164個(gè)氨基酸組成的錯(cuò)構(gòu)瘤蛋白。TSC2基因含有41個(gè)編碼外顯子和1個(gè)無編碼意義的引導(dǎo)外顯子,轉(zhuǎn)錄為相對(duì)分子質(zhì)量為5.5的mRNA,編碼相對(duì)分子質(zhì)量為2×105,由1807個(gè)氨基酸組成的馬鈴薯球蛋白(tuberin)。上述兩種蛋白可形成一種復(fù)合體,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生長、黏附及囊泡運(yùn)輸?shù)萚6, 7]。對(duì)于TSC的患者進(jìn)行基因檢測(cè),可有75%~85%的患者檢測(cè)到TSC1或TSC2基因的突變,且大部分突變發(fā)生在TSC2基因上,約占總突變檢出率的82%[8, 9]。TSC是一種表型多樣的疾病,Dabora等曾經(jīng)對(duì)224名TSC患者進(jìn)行突變檢測(cè)發(fā)現(xiàn),TSC2基因發(fā)生突變的患者臨床表現(xiàn)更嚴(yán)重,較易發(fā)生智力發(fā)育遲緩、癲癇、面部血管纖維瘤及視網(wǎng)膜錯(cuò)構(gòu)瘤等[10]。部分TSC1突變患者無陽性癥狀,要通過基因檢測(cè)方可診斷。因此早期基因診斷尤為重要。且仍有10%~25%患者尚未找到相應(yīng)的基因突變位點(diǎn),突變規(guī)律、突變后信息傳遞過程仍在進(jìn)一步研究中,產(chǎn)前診斷、基因治療等臨床問題迫切需要解決,探索結(jié)節(jié)性硬化癥致病基因更快速、簡(jiǎn)便的診斷方法刻不容緩[11]。

    表3 39例經(jīng)二代測(cè)序檢測(cè)到的致病性TSC1/2基因突變情況

    既往較常采用的基因檢測(cè)方法包括:變性高效液相色譜(DHPLC)法、DNA直接測(cè)序技術(shù)(DNA-sequencing)和多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation.dependent probe amplification, MLPA)。DNA直接序法因靈敏度較低,操作復(fù)雜、耗時(shí),常與DHPLC法、MLPA法聯(lián)用,甚至逐漸被改進(jìn)的DHPLC法、MLPA法所取代。DHPLC法及MLPA法均可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶基因位點(diǎn)或突變片段,且智能化程度高,所需樣本量少,曾經(jīng)廣泛應(yīng)用于TSC致病基因篩查及實(shí)際臨床診治工作[12]。近年來,新的基因診斷技術(shù)如原子探針顯微鏡測(cè)序法、DNA芯片法及熒光SSCP測(cè)序技術(shù)等均開始應(yīng)用于TSC突變基因的檢測(cè),大大提高了對(duì)TSC患者臨床診治工作的效率,也可為結(jié)節(jié)性硬化癥在分子遺傳學(xué)等方面的深入研究提供更好的平臺(tái)[13、14]。

    目標(biāo)序列捕獲二代測(cè)序技術(shù)是一種高通量測(cè)序技術(shù),具有高準(zhǔn)確性、高通量、高靈敏度及低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì),與傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)相比,更加省時(shí)。相比于第一代測(cè)序技術(shù),NGS采用反應(yīng)實(shí)時(shí)閱讀技術(shù),顯著縮短了檢測(cè)時(shí)間,并可將測(cè)序費(fèi)用降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。與傳統(tǒng)Sanger測(cè)序、PCR及定量PCR等檢測(cè)方式相比,NGS在全面解決多基因及遺傳異質(zhì)性疾病方面更具優(yōu)勢(shì),可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣本的檢測(cè),而且對(duì)于SNV、缺失或重復(fù)的檢測(cè)準(zhǔn)確性更高。相比于MLPA和單核苷酸多態(tài)性微陣列(SNP-array)等相對(duì)高通量檢測(cè)技術(shù),NGS不僅可檢測(cè)出已知的致病性突變,還可以發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn),同時(shí)能避免上述技術(shù)檢測(cè)存在的基因SNP的種族差異性(假陰性)[15, 16]。隨著NGS技術(shù)的發(fā)展,NGS 已越來越多的應(yīng)用于遺傳病的診斷中,并體現(xiàn)出相對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序快速、準(zhǔn)確、低成本、高覆蓋度等優(yōu)勢(shì)。目前NGS 在遺傳病診斷應(yīng)用中主要有全基因組測(cè)序(whole genome sequencing, WGS) 、全外顯子測(cè)序(whole exon sequencing, WES)及靶向基因測(cè)序幾種[17]。靶向基因測(cè)序因僅需對(duì)與疾病密切相關(guān)的幾個(gè)或幾十個(gè)基因通過定制探針、芯片或PCR技術(shù)進(jìn)行特異性捕獲,性價(jià)比相對(duì)更高。應(yīng)用NGS技術(shù),通過加深測(cè)序深度,不僅可以發(fā)現(xiàn)低比例的嵌合突變,同時(shí)也將很多的非編碼區(qū)進(jìn)行檢測(cè)。NGS技術(shù)不僅可以檢測(cè)點(diǎn)突變、微小插入或缺失,也可以通過算法得到大片段重復(fù)、缺失的結(jié)果,這些都有助提高TSC基因的陽性檢出率[18~20]。

    本研究患者在接受PCR-SSCP基因測(cè)序中,盡管總體突變檢出率高于高通量二代測(cè)序,但是在TSC人群和散發(fā)性AML人群中檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其結(jié)果僅能定位于外顯子,缺少突變類型以及氨基酸變化等分析,直接影響到對(duì)致病性的分析。而在高通量二代測(cè)序中,在TSC患者中的突變率為72.3%,其中TSC2突變比例為84.6%,與既往文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)相近[21]。此次共檢測(cè)到32種突變,通過對(duì)比LOVD突變數(shù)據(jù)庫(http://chromium.liacs.nl/LOVD2 /TSC),大部分突變?yōu)橐褕?bào)道突變,4個(gè)臨床意義未明確突變中:TSC2外顯子18的C.1939G>A錯(cuò)義突變的臨床意義仍不能明確,TSC1外顯子15的C.1700C>T錯(cuò)義突變患者病理確診為惡性腎血管周上皮樣細(xì)胞瘤,因此推測(cè)這一突變可能具有致病性。而位于TSC2外顯子30的C.3610G>A錯(cuò)義突變,位于TSC1的C.*1717-55T>C錯(cuò)義突變以及位于TSC2的C.*2626-4delT大片段缺失突變患者均符合TSC臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),因此推測(cè)這兩個(gè)突變?yōu)橹虏⌒酝蛔?。?個(gè)新發(fā)現(xiàn)突變分別是位于TSC2基因的C.-29-6G>A剪切突變和位于TSC1外顯子15的C.1916G>T錯(cuò)義突變,患者的臨床特征均未能確診為TSC,因此其臨床意義尚不明確。

    綜上所述,隨著基因診斷廣泛應(yīng)用于TSC疾病的診斷,更加便捷、精準(zhǔn)、價(jià)廉的基因檢測(cè)手段將不斷涌現(xiàn)。通過對(duì)TSC1/2基因突變的深入分析,越來越多的致病基因?qū)⒈话l(fā)現(xiàn),而基因突變與TSC臨床表型、藥物療效等的相關(guān)性也將逐步明晰。

    猜你喜歡
    錯(cuò)義高通量外顯子
    利用AlphaMissense準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)組的錯(cuò)義突變
    高通量衛(wèi)星網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)漫游關(guān)鍵技術(shù)
    國際太空(2023年1期)2023-02-27 09:03:42
    外顯子跳躍模式中組蛋白修飾的組合模式分析
    初雪
    GJA8基因錯(cuò)義突變致先天性白內(nèi)障一家系遺傳分析
    外顯子組測(cè)序助力產(chǎn)前診斷胎兒骨骼發(fā)育不良
    高通量血液透析臨床研究進(jìn)展
    Ka頻段高通量衛(wèi)星在鐵路通信中的應(yīng)用探討
    外顯子組測(cè)序助力產(chǎn)前診斷胎兒骨骼發(fā)育不良
    中國通信衛(wèi)星開啟高通量時(shí)代
    а√天堂www在线а√下载| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久久久国产一级毛片高清牌| 高潮久久久久久久久久久不卡| 色老头精品视频在线观看| 此物有八面人人有两片| 久久久久久大精品| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品高清国产在线一区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 好男人电影高清在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| www.999成人在线观看| 国产高清激情床上av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 久久久久久久久免费视频了| 欧美一级a爱片免费观看看 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 不卡av一区二区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲熟女毛片儿| 国产成人欧美| 午夜视频精品福利| 久久精品91蜜桃| 一级黄色大片毛片| 手机成人av网站| 一区二区三区高清视频在线| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲黑人精品在线| www.精华液| 不卡av一区二区三区| 午夜福利18| av有码第一页| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美乱码精品一区二区三区| 男人舔奶头视频| 国产精品九九99| 午夜福利视频1000在线观看| 精品第一国产精品| 老汉色∧v一级毛片| 一进一出好大好爽视频| 国产成人影院久久av| 校园春色视频在线观看| 精品福利观看| 国产精品,欧美在线| 精品久久久久久久末码| 国产精品久久电影中文字幕| 久久香蕉精品热| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日本a在线网址| 国产成人av教育| 我的亚洲天堂| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲中文av在线| 两性夫妻黄色片| 大香蕉久久成人网| 日韩精品青青久久久久久| 99国产精品一区二区三区| 国产激情久久老熟女| av片东京热男人的天堂| √禁漫天堂资源中文www| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久国产精品影院| 好男人电影高清在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产亚洲欧美98| 中文字幕人妻熟女乱码| 丝袜美腿诱惑在线| 色播亚洲综合网| 久久性视频一级片| 美女 人体艺术 gogo| 热99re8久久精品国产| 夜夜夜夜夜久久久久| 午夜福利成人在线免费观看| 9191精品国产免费久久| 欧美日本亚洲视频在线播放| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲第一电影网av| 身体一侧抽搐| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 一进一出抽搐gif免费好疼| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 女警被强在线播放| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲国产精品sss在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 精品久久久久久久久久久久久 | 久久中文看片网| 黄片大片在线免费观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美大码av| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲在线自拍视频| 黑人操中国人逼视频| 不卡av一区二区三区| 一二三四在线观看免费中文在| 动漫黄色视频在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 波多野结衣av一区二区av| 99精品欧美一区二区三区四区| 黄频高清免费视频| 精品欧美国产一区二区三| 国产97色在线日韩免费| 黄片播放在线免费| 亚洲专区字幕在线| 成人特级黄色片久久久久久久| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 最近最新中文字幕大全电影3 | 1024香蕉在线观看| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲专区国产一区二区| 久久久久久大精品| svipshipincom国产片| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 成年人黄色毛片网站| 99热6这里只有精品| 国产单亲对白刺激| 黄色a级毛片大全视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美亚洲日本最大视频资源| 啦啦啦免费观看视频1| 久久中文字幕人妻熟女| 国产精华一区二区三区| 国产97色在线日韩免费| 日韩欧美在线二视频| 看免费av毛片| 久久久国产欧美日韩av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美久久黑人一区二区| 日韩欧美 国产精品| 久久中文字幕人妻熟女| 午夜久久久久精精品| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲欧美激情综合另类| 女同久久另类99精品国产91| 91成年电影在线观看| 免费在线观看成人毛片| 午夜激情av网站| 日韩欧美三级三区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产欧美日韩一区二区三| 麻豆成人午夜福利视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | а√天堂www在线а√下载| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 正在播放国产对白刺激| 欧美久久黑人一区二区| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久香蕉精品热| 亚洲国产精品999在线| 欧美黑人精品巨大| 男女之事视频高清在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 免费在线观看亚洲国产| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 精品欧美国产一区二区三| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲人成电影免费在线| 美女 人体艺术 gogo| 两性夫妻黄色片| av福利片在线| 亚洲免费av在线视频| 日本在线视频免费播放| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久青草综合色| 国产1区2区3区精品| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产亚洲精品一区二区www| 日韩国内少妇激情av| 一级黄色大片毛片| 999久久久国产精品视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国产亚洲欧美98| 亚洲avbb在线观看| 国产av一区在线观看免费| 怎么达到女性高潮| netflix在线观看网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 免费无遮挡裸体视频| 久久香蕉精品热| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 在线视频色国产色| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲久久久国产精品| 久久久国产精品麻豆| videosex国产| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美日韩乱码在线| 给我免费播放毛片高清在线观看| 在线看三级毛片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 色综合婷婷激情| 国语自产精品视频在线第100页| ponron亚洲| 国产又色又爽无遮挡免费看| 午夜a级毛片| 亚洲片人在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 黄色视频,在线免费观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产极品粉嫩免费观看在线| 女人被狂操c到高潮| 国产片内射在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 色老头精品视频在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 长腿黑丝高跟| 国产成人精品无人区| 麻豆国产av国片精品| 成人亚洲精品av一区二区| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产亚洲精品一区二区www| 在线观看66精品国产| 欧美一区二区精品小视频在线| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久中文看片网| 91av网站免费观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久久水蜜桃国产精品网| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产成人欧美在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲国产精品合色在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 色综合亚洲欧美另类图片| 91成年电影在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲av成人一区二区三| 精品久久久久久,| 午夜福利在线观看吧| 国产精品一区二区免费欧美| 久久久久久人人人人人| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 在线观看午夜福利视频| 久久伊人香网站| 欧美三级亚洲精品| 亚洲国产看品久久| 精品免费久久久久久久清纯| 国产欧美日韩一区二区精品| 中文在线观看免费www的网站 | 国产黄片美女视频| 性色av乱码一区二区三区2| 我的亚洲天堂| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 婷婷精品国产亚洲av在线| 午夜福利视频1000在线观看| 一级黄色大片毛片| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲avbb在线观看| 亚洲全国av大片| 一本久久中文字幕| 欧美日韩精品网址| 一夜夜www| 脱女人内裤的视频| 国产精品二区激情视频| 日韩欧美国产在线观看| 日本 av在线| 很黄的视频免费| 黄色成人免费大全| 欧美成人性av电影在线观看| 丁香六月欧美| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 正在播放国产对白刺激| 国产精品久久久av美女十八| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 欧美亚洲日本最大视频资源| 91国产中文字幕| 亚洲最大成人中文| 午夜亚洲福利在线播放| 久久久久久久久中文| 在线免费观看的www视频| 欧美一级毛片孕妇| 午夜福利18| 日本一区二区免费在线视频| 日韩欧美 国产精品| 一本久久中文字幕| 久久香蕉精品热| 人成视频在线观看免费观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 9191精品国产免费久久| 久久久水蜜桃国产精品网| 制服人妻中文乱码| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产野战对白在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 免费在线观看影片大全网站| 1024手机看黄色片| 老司机靠b影院| 男人的好看免费观看在线视频 | 中出人妻视频一区二区| 97碰自拍视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩高清综合在线| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产高清有码在线观看视频 | 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 最近最新中文字幕大全免费视频| 又黄又粗又硬又大视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产成人av激情在线播放| 欧美午夜高清在线| 高清在线国产一区| 欧美午夜高清在线| 久久人妻av系列| 日本 av在线| 特大巨黑吊av在线直播 | 国产av一区在线观看免费| www日本黄色视频网| 亚洲欧美激情综合另类| 免费看a级黄色片| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日韩欧美国产一区二区入口| aaaaa片日本免费| 成人国产一区最新在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久久久久免费高清国产稀缺| 这个男人来自地球电影免费观看| 少妇 在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久精品国产综合久久久| 久久香蕉国产精品| 久久青草综合色| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 精品久久久久久久久久久久久 | 精品欧美一区二区三区在线| 午夜影院日韩av| av片东京热男人的天堂| 波多野结衣av一区二区av| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩有码中文字幕| 麻豆久久精品国产亚洲av| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产精品 国内视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 免费搜索国产男女视频| 女同久久另类99精品国产91| 欧美乱妇无乱码| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 亚洲国产精品sss在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产又爽黄色视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产真人三级小视频在线观看| 女人被狂操c到高潮| 精品久久久久久,| 首页视频小说图片口味搜索| 成人三级黄色视频| 久久草成人影院| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产片内射在线| 18禁国产床啪视频网站| 怎么达到女性高潮| 91成年电影在线观看| 色播在线永久视频| 国产伦人伦偷精品视频| 白带黄色成豆腐渣| 中国美女看黄片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| www.www免费av| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲专区中文字幕在线| 女警被强在线播放| 91成人精品电影| 国产97色在线日韩免费| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 91麻豆精品激情在线观看国产| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲精品色激情综合| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲在线自拍视频| videosex国产| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲黑人精品在线| 亚洲电影在线观看av| 亚洲成av人片免费观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 在线看三级毛片| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产成年人精品一区二区| 窝窝影院91人妻| av有码第一页| 又黄又粗又硬又大视频| 精品久久久久久久末码| 999精品在线视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产野战对白在线观看| 欧美中文综合在线视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美性长视频在线观看| 在线观看午夜福利视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产精品永久免费网站| 深夜精品福利| 一级毛片高清免费大全| 18禁美女被吸乳视频| 国产黄片美女视频| 国产av又大| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产成人欧美在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 黄片播放在线免费| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 18禁观看日本| 老鸭窝网址在线观看| 无限看片的www在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 男人舔女人的私密视频| 免费搜索国产男女视频| 国产黄片美女视频| 人成视频在线观看免费观看| 日本熟妇午夜| 亚洲av第一区精品v没综合| 色播在线永久视频| 久久中文字幕人妻熟女| 一级毛片高清免费大全| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 亚洲男人天堂网一区| 精品欧美国产一区二区三| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久久精品欧美日韩精品| 又黄又粗又硬又大视频| 又大又爽又粗| 久久久久久人人人人人| 久久草成人影院| 精品国产美女av久久久久小说| 看免费av毛片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲一区中文字幕在线| 一本一本综合久久| 亚洲精品在线观看二区| 国产久久久一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区久久 | 亚洲av美国av| 99国产精品99久久久久| 久久久久久久精品吃奶| 动漫黄色视频在线观看| e午夜精品久久久久久久| 国产主播在线观看一区二区| 99精品在免费线老司机午夜| 一夜夜www| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 免费在线观看黄色视频的| 成人三级黄色视频| xxx96com| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲人成电影免费在线| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美一级a爱片免费观看看 | 成人三级做爰电影| 亚洲国产看品久久| 国产区一区二久久| 两个人免费观看高清视频| 国产av一区在线观看免费| 久久欧美精品欧美久久欧美| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美大码av| 黄片小视频在线播放| 中文在线观看免费www的网站 | 两人在一起打扑克的视频| 国产av一区二区精品久久| 九色国产91popny在线| 成人免费观看视频高清| 国产乱人伦免费视频| av福利片在线| 久久狼人影院| 免费在线观看日本一区| 日本免费a在线| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 午夜福利18| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| or卡值多少钱| 国产精品一区二区精品视频观看| 女警被强在线播放| 国产高清激情床上av| 中文字幕av电影在线播放| 男女之事视频高清在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 深夜精品福利| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产色视频综合| 久久久久亚洲av毛片大全| 高清在线国产一区| 久久久精品欧美日韩精品| 一级黄色大片毛片| 在线看三级毛片| 国产高清激情床上av| 国产av一区在线观看免费| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产单亲对白刺激| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 老司机深夜福利视频在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 国内精品久久久久久久电影| av天堂在线播放| x7x7x7水蜜桃| 久久久国产欧美日韩av| 少妇的丰满在线观看| 国产高清激情床上av| 国产av一区在线观看免费| 欧美激情 高清一区二区三区| 91老司机精品| 久久精品影院6| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩视频一区二区在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品98久久久久久宅男小说| a在线观看视频网站| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 亚洲电影在线观看av| 久9热在线精品视频| 日韩精品青青久久久久久| 欧美丝袜亚洲另类 | 99久久国产精品久久久| 国产精品久久久av美女十八| 国产片内射在线| 国产av不卡久久| 看黄色毛片网站| 色播亚洲综合网| 韩国精品一区二区三区| 午夜久久久久精精品| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲人成77777在线视频| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 制服人妻中文乱码| 国产精品免费一区二区三区在线| 观看免费一级毛片| 国产精品久久久久久精品电影 | 日本五十路高清| 在线av久久热| 日韩精品免费视频一区二区三区| 天堂影院成人在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 午夜免费激情av| 黑人操中国人逼视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品98久久久久久宅男小说| 午夜福利视频1000在线观看| 日韩欧美 国产精品| 午夜老司机福利片| 国产精品影院久久| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| svipshipincom国产片| 深夜精品福利| 人人妻人人看人人澡| 制服丝袜大香蕉在线| 久热爱精品视频在线9| 国产av又大| 免费看a级黄色片| √禁漫天堂资源中文www| 国产成年人精品一区二区| 中文字幕高清在线视频| 一夜夜www| 熟女电影av网| 热99re8久久精品国产| www日本黄色视频网| 观看免费一级毛片| 淫秽高清视频在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 一区二区三区精品91| 97碰自拍视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲精品色激情综合| 黑人操中国人逼视频| 亚洲黑人精品在线| 老汉色∧v一级毛片| 欧美中文日本在线观看视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久热爱精品视频在线9| 国产v大片淫在线免费观看|