AMPKα2在高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)激活小鼠骨骼肌細(xì)胞自噬過(guò)程中的作用

謝凌堅(jiān) 張珊 劉素娟 傅力

天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（天津 300070）

隨著對(duì)運(yùn)動(dòng)改善機(jī)體代謝研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)形式、頻率、強(qiáng)度等是影響運(yùn)動(dòng)效果的重要因素。高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)（high-intensity interval training，HIIT）作為一種省時(shí)高效的運(yùn)動(dòng)模式，逐漸受到人們的重視。HIIT是指短時(shí)間的間歇配合最大或接近于VO2max強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練[1]。有研究顯示，與傳統(tǒng)中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)（moderate intensity continuous training，MICT）相比，HIIT表現(xiàn)出更為優(yōu)越的減脂效應(yīng)。不僅如此，HIIT對(duì)間接反映健康水平的體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI） 也有很好的控制效果[2]。

自噬是細(xì)胞內(nèi)囊泡吞噬自身錯(cuò)誤折疊蛋白或衰老細(xì)胞器，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體以降解其內(nèi)容物的細(xì)胞自我更新過(guò)程[3]，細(xì)胞通過(guò)自噬調(diào)節(jié)細(xì)胞組分使其得到有序降解和更新[4，5]。自噬在疾病過(guò)程中被認(rèn)為是對(duì)應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，通過(guò)自噬可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的適應(yīng)能力[6]。此外自噬還可為組織細(xì)胞快速提供燃料[7]，在HIIT造成細(xì)胞能量迅速消耗時(shí)，骨骼肌細(xì)胞是否通過(guò)激活自噬應(yīng)對(duì)“饑餓”狀態(tài)，目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)AMPK（AMP activated protein kinase）在誘導(dǎo)細(xì)胞自噬過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[22]，而在HIIT影響骨骼肌細(xì)胞自噬過(guò)程中，AMPKα2（AMPK的催化亞基）在其中的作用如何目前未見報(bào)道。因此，本研究通過(guò)采用AMPKα2基因敲除小鼠并對(duì)小鼠進(jìn)行6周HIIT干預(yù)，探討在AMPKα2缺失的情況下，HIIT對(duì)小鼠代謝表型以及骨骼肌細(xì)胞自噬活性的影響，以期為揭示HIIT干預(yù)生物學(xué)效應(yīng)的可能機(jī)制，以及AMPKα2在HIIT影響骨骼肌細(xì)胞自噬活性中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

AMPKα2基因敲除小鼠由法國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院Benoit Viollet博士提供，于天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)繁殖。取不同基因型 C57BL/6雄性小鼠共36只（4周齡），其中AMPKα2+/+，AMPKα2+/-，AMPKα2-/-各12只，期間小鼠自由進(jìn)食、水，飼料為基礎(chǔ)維持飼料（營(yíng)養(yǎng)成分包含：水分≤8.0%，粗脂肪≥4.0%，粗纖維≤5.0%，粗蛋白≥18.0%）。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，各基因型分別隨機(jī)分為安靜對(duì)照組（Control組）和高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)組（HIIT組），每組6只。運(yùn)動(dòng)干預(yù)6周，強(qiáng)度為2分鐘85%VO2max與1分鐘50%VO2max（參照Fernando等制定的速度與最大攝氧量對(duì)應(yīng)表）的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)交替進(jìn)行12個(gè)循環(huán)[8]，1次/天、5次/周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每周測(cè)量小鼠體重，6周運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后小鼠安靜24小時(shí)后開始進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 體成分檢測(cè)

各組小鼠使用ImpediVET進(jìn)行體成分分析，步驟如下：（1）使用異氟烷麻醉受試小鼠，使其四肢張開、鼠尾伸直，俯臥位置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，將插電極處皮膚經(jīng)備皮處理；（2）按電極布置圖將插入電極與導(dǎo)線相連接，測(cè)量中間兩個(gè)電極間距離；（3）輸入受試小鼠體重以及兩電極間距等信息，最后點(diǎn)擊“Measure”開始測(cè)量。測(cè)試完成后，ImpediVET軟件將生成綜合報(bào)告，記錄小鼠的總體液量（total body water）、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、體脂含量（fat mass）等指標(biāo)。

1.4 動(dòng)物取材

不同組小鼠干預(yù)結(jié)束后，禁食12小時(shí)，采用眼內(nèi)眥采血法收集小鼠血液樣本，提取血清。隨后迅速斷頸處死，分離小鼠股四頭肌，經(jīng)液氮速凍后，轉(zhuǎn)存于-80℃ 冰箱備用。

1.5 檸檬酸合酶（Citrate synthase，CCSS）活性檢測(cè)

操作步驟如下：

（1）經(jīng)液氮研磨的100 mg股四頭肌組織放入預(yù)冷裂解液中充分混勻，13000 g離心10分鐘，取上清，采用BCA法測(cè)蛋白濃度;

（3）200 μl CS待測(cè)液中各組分為：1）0.1 mM DTNB；2）10%Triton X-100；3）0.31 mM acetyl CoA；4）5 μg待測(cè)骨骼肌蛋白。

（4）加入10 μl 10 mM oxalacetate后將待測(cè)液放入30°C恒溫分光光度計(jì)，測(cè)定412 nm波長(zhǎng)處光密度值，持續(xù)3 min，每隔 20 s記錄一次。

（5）酶活力單位是U/min/g，計(jì)算公式如下：

1.6 Western Blot法檢測(cè)各組小鼠骨骼肌AMPKα2，pAMPK-Thr172，以及自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ，p62，Beclin1表達(dá)。

1.6.1 樣品提取

（1）1%NP-40法提取股四頭肌總蛋白，其中裂解液包含：1%NP-40+EDTA 15 mM（pH 8.0）+Na-Cl 150 mM+Tris 50 mM，充分混勻；（2）1×Phosphatase Inhibitor+1×Protease Inhibitor+400 μl裂解液/100 mg組織，電動(dòng)勻漿；（3）低溫離心機(jī)15000 g、4°C，離心20 min，回收上清，取上清液測(cè)定蛋白濃度。

1.6.2 SDS-PAGE凝膠電泳

制備5%積層膠，根據(jù)目的蛋白分子量，制備不同濃度分離膠，等量總蛋白加入樣品孔，預(yù)染蛋白Marker 3 μl加入一側(cè)加樣孔。于凝膠電泳緩沖液（pH 7.6）內(nèi)60 V電壓電泳30分鐘后，再轉(zhuǎn)換成100 V電壓繼續(xù)電泳2小時(shí)。

1.6.3 電轉(zhuǎn)印

采用濕法電轉(zhuǎn)印法，轉(zhuǎn)膜2小時(shí)（電流：300 mA）。根據(jù)預(yù)染蛋白Marker的轉(zhuǎn)移情況，判斷蛋白轉(zhuǎn)移情況。

1.6.4 Western Blot

轉(zhuǎn)膜結(jié)束→1×TBST洗滌PVDF膜（1次）→5%脫脂牛奶封閉（1小時(shí)）→1×TBST洗滌 PVDF膜（1次），5%BSA稀釋一抗，具體比例見表1，4°C過(guò)夜孵育。次日，1×TBST洗膜（10分鐘×3次）→二抗（5%BSA按照不同二抗說(shuō)明書稀釋）室溫孵育（1小時(shí)）→1×TBST洗膜（10分鐘×3次）；ECL反應(yīng)液做發(fā)光底物，暗室曝光（X光膠片）→顯影→定影→觀察、掃描、應(yīng)用相關(guān)軟件分析結(jié)果。

1.6.5 抗體稀釋比例

1.7 數(shù)理統(tǒng)計(jì)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差（±s），單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為組間顯著差異性標(biāo)準(zhǔn)。

表1 抗體稀釋比例

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 HIIT對(duì)各組小鼠體重增長(zhǎng)的影響

本實(shí)驗(yàn)各組小鼠自4周齡起每周測(cè)量體重（body weight）并記錄。小鼠體重變化情況如圖1所示。在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后和運(yùn)動(dòng)干預(yù)開始后第1周末，各基因型組小鼠與安靜對(duì)照同基因型組小鼠相比體重?zé)o顯著性差異（P＞0.05）。但是，自HIIT干預(yù)第2周起，HIIT組各基因型與安靜對(duì)照組相比體重開始下降，到6周運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后，HIIT組與安靜對(duì)照組小鼠相比體重分別下降 9.62%（AMPKα2+/+），8.40%（AMPKα2+/-） 和3.53%（AMPKα2-/-），具顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠體重變化

2.2 HIIT對(duì)各組小鼠體成分的影響

6周運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，對(duì)各組小鼠分別進(jìn)行體成分分析，結(jié)果如表2所示。HIIT干預(yù)的野生型AMPKα2+/+和雜合子AMPKα2+/-組與安靜對(duì)照Control組同基因型小鼠相比BMI值下降顯著，分別下降了18.61%和20.35%（P＜0.05）；各組小鼠身體水分總量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；HIIT干預(yù)的AMPKα2+/+和AMPKα2+/-組小鼠與Control組同基因型小鼠相比，體脂含量顯著下降，分別下 降 了 48.96% （AMPKα2+/+） 和 34.05% （AMPKα 2+/-）（P＜0.05）。但是，HIIT干預(yù)對(duì)AMPKα2-/-組小鼠BMI和體脂含量的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠體成分

2.3 HIIT對(duì)各組小鼠骨骼肌檸檬酸合酶的影響

檸檬酸合酶是組織細(xì)胞葡萄糖有氧氧化過(guò)程中三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵限速酶，本研究檢測(cè)HIIT干預(yù)后小鼠股四頭肌組織CS活性，以評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果。結(jié)果如圖2所示，6周HIIT可顯著增加AMPKα2+/+及AMPKα 2+/-組小鼠股四頭肌CS活性（P＜0.05）；而在AMPKα2-/-小鼠股四頭肌組織CS活性增加無(wú)顯著性（P＞0.05）。

圖2 HIIT對(duì)各組小鼠骨骼肌檸檬酸合酶的影響

2.4 AMPKα2在HIIT影響骨骼肌自噬中的作用

為探究AMPKα2在其中發(fā)揮的作用，我們對(duì)三種基因型小鼠骨骼肌組織AMPKα2蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，基因敲除小鼠AMPKα2蛋白表達(dá)缺失，驗(yàn)證小鼠基因型準(zhǔn)確無(wú)誤。

為探究HIIT所造成的細(xì)胞能量應(yīng)激能否對(duì)骨骼肌細(xì)胞自噬活性產(chǎn)生影響以及AMPKα2在其中的可能作用，我們對(duì)不同基因型小鼠股四頭肌自噬相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，經(jīng)過(guò)6周的HIIT后，AMPKα 2+/+和AMPKα2+/-組小鼠骨骼肌AMPK-Thr172位點(diǎn)磷酸化水平顯著提高，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ，Beclin1的表達(dá)顯著增加（P＜0.05），p62表達(dá)顯著減少（P＜0.05），提示HIIT能夠促進(jìn)AMPK-Thr172位點(diǎn)的磷酸化，進(jìn)而提高骨骼肌細(xì)胞自噬水平。而AMPKα2-/-小鼠HIIT組與Control組相比，股四頭肌LC3Ⅱ/Ⅰ，Beclin1和p62差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 Western blot檢測(cè)各組小鼠AMPKα2表達(dá)量

圖4 HIIT對(duì)各組小鼠骨骼肌自噬活性的影響

3 討論

3.1 AMPKα2在HIIT控制體重和BMIBMI、改善體成分方面發(fā)揮重要作用

近年來(lái)隨著HIIT在全民健身運(yùn)動(dòng)中的逐步應(yīng)用，其在增強(qiáng)人體循環(huán)、呼吸、代謝功能方面的作用也日漸凸顯。有研究發(fā)現(xiàn)，每周3次、持續(xù)3周的HIIT可顯著降低青少年個(gè)體的體重、BMI，同時(shí)增加瘦體重[9]。此外，HIIT結(jié)合地中海飲食（素食為主，注重營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量）能夠顯著改善肥胖患者身體組成和胰島素敏感性[10]。因此，HIIT對(duì)改善機(jī)體代謝的調(diào)控機(jī)制急需進(jìn)一步深入探討。

AMPK是細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵分子，也是糖尿病及其他代謝相關(guān)疾病研究的核心分子之一。AMPK由α （α1和α2），β（β1和β2）和γ（γ1，γ2，γ3）三種亞基構(gòu)成的異源三聚體，α亞基N端含有一個(gè)典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，而蘇氨酸172位點(diǎn)（Thr172）的磷酸化對(duì)于激活A(yù)MPK是必需的。不同亞基的各亞型具有組織分布特異性，在骨骼肌組織中以α2，β2和γ3亞型的表達(dá)為主[11]。在健康或糖尿病個(gè)體中，大于70%VO2max的運(yùn)動(dòng)可激活含α2催化亞基的AMPK復(fù)合體[12，13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)MPK可增加糖和脂質(zhì)的利用[10]，表明運(yùn)動(dòng)所激活的AMPK可能通過(guò)調(diào)控糖、脂代謝改善機(jī)體能量代謝。

研究顯示，HIIT可有效增加AMPKα2磷酸化活性。Gibala等人發(fā)現(xiàn)HIIT能顯著增加股外側(cè)肌AMPKα2的mRNA水平，推測(cè)HIIT所引起AMPKα2的表達(dá)增加可能影響細(xì)胞線粒體生物合成、增加葡萄糖攝取利用和脂肪酸氧化等[14]。為揭示AMPKα2在HIIT改善機(jī)體代謝中的作用，本研究采用AMPKα2敲除小鼠為模型對(duì)其進(jìn)行HIIT干預(yù)，通過(guò)與各基因型安靜對(duì)照小鼠進(jìn)行對(duì)比，探討AMPKα2在其中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管HIIT可控制AMPKα2-/-小鼠體重，但作用弱于其對(duì)野生型小鼠的效果，更值得注意的是，HIIT在控制AMPKα2-/-小鼠BMI、降低脂肪量方面，未表現(xiàn)出顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示AMPKα2在HIIT控制體重、降低BMI，改善體脂含量等重要健康指標(biāo)方面發(fā)揮著重要作用。

3.2 AMPKα2在HIIT增加骨骼肌檸檬酸合酶活性過(guò)程中的作用

CS主要位于真核細(xì)胞線粒體基質(zhì)[15]，是能量產(chǎn)生代謝途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一，其活性及表達(dá)量常被用作判定組織細(xì)胞氧化能力的重要指標(biāo)[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6周HIIT干預(yù)顯著增加了小鼠股四頭肌組織CS活性，提示運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果顯著，骨骼肌有氧氧化能力顯著增加。

骨骼肌作為機(jī)體糖和脂質(zhì)有氧氧化的主要組織，在調(diào)節(jié)全身能量代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，AMPK在調(diào)節(jié)機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力、骨骼肌線粒體融合分裂和細(xì)胞葡萄糖攝取等方面發(fā)揮重要作用[17]。諸多研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)AICAR或其他細(xì)胞因子激活A(yù)MPK可顯著增加骨骼肌脂肪酸氧化[18]。骨骼肌組織過(guò)表達(dá)AMPK可增加脂肪酸氧化，并防止高脂飲食誘導(dǎo)的骨骼肌脂質(zhì)沉積[19]。以上研究表明骨骼肌AMPK在調(diào)節(jié)脂肪酸氧化中的重要作用。本研究也證實(shí)骨骼肌組織AMPKα2缺失，影響了三羧酸循環(huán)限速酶——CS的活性，推測(cè)AMPKα2在調(diào)控骨骼肌能量代謝中可能發(fā)揮著重要作用。

3.3 AMPKα2在HIIT影響骨骼肌細(xì)胞自噬中的作用

機(jī)體基礎(chǔ)自噬水平隨著衰老而逐漸減弱，導(dǎo)致清除錯(cuò)誤折疊蛋白和衰老細(xì)胞器的效率降低[20，21]，8周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可使老年小鼠骨骼肌組織Atg7，Beclin-1和LC3Ⅱ表達(dá)上調(diào)[21]，提示有氧運(yùn)動(dòng)可增加老年小鼠骨骼肌基礎(chǔ)自噬水平、改善衰老小鼠機(jī)體健康狀態(tài)。另有研究發(fā)現(xiàn)，2小時(shí)低強(qiáng)度或高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，股外側(cè)肌組織LC3Ⅱ，p62/SQSTM1的mRNA水平僅在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)干預(yù)后顯著增加，推測(cè)骨骼肌細(xì)胞自噬活性的增加與運(yùn)動(dòng)干預(yù)強(qiáng)度有關(guān)。不僅如此，Schwalm等人還發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后增加的自噬水平可能與AMPKα活性增加有關(guān)，其依據(jù)是高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組比低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組表現(xiàn)出更高的pAMPK-Thr172和pACC-Ser79磷酸化水平[22]。由此可見，HIIT可有效激活細(xì)胞自噬水平，提高機(jī)體對(duì)應(yīng)激狀態(tài)的適應(yīng)能力。本研究也發(fā)現(xiàn)，6周HIIT能顯著增加小鼠骨骼肌組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)、增強(qiáng)自噬活性，同時(shí)AMPK-Thr172位點(diǎn)磷酸化水平顯著提高。但是，6周HIIT干預(yù)對(duì)AMPKα2基因敲除組小鼠骨骼肌自噬活性無(wú)明顯增加效應(yīng)，提示AMPKα2在HIIT激活自噬過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)可明顯改善小鼠體成分、增強(qiáng)骨骼肌有氧代謝能力和自噬活性，AMPKα2在此過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。