應(yīng)用總DNA 花粉管導(dǎo)入法改良野生興安石竹品質(zhì)培育花卉新品種研究

王東紅，郭曉雷，于紅梅，魏紅梅

（呼和浩特市植物園，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000）

隨著園林綠化事業(yè)逐漸向生態(tài)型、節(jié)約型和多樣化方向發(fā)展，城鄉(xiāng)園林綠化要優(yōu)先使用成本低、適應(yīng)性強、本地特色鮮明的鄉(xiāng)土樹種及花草。內(nèi)蒙古中西部地區(qū)干旱、半干旱野生植物資源豐富，是天然的抗性基因庫。合理開發(fā)利用野生植物資源，不僅能打造出具有地方特色的景觀，而且對城市生態(tài)環(huán)境建設(shè)和生物多樣性保護具有重要意義[1]。

呼和浩特市園林科研所自2005 年成立“野生植物研究課題組”以來，系統(tǒng)調(diào)查和研究了內(nèi)蒙古中西部地區(qū)野生植物的分布范圍、生境狀況、生長海拔、土壤性質(zhì)等，對具有較高觀賞效果和較強抗逆性的野生植物成功進行引種馴化。截至目前，完成引種馴化栽培和遷地移栽品種共計40 個科104 個屬174 種，馴化成功130 余種，其中，篩選出50 種具有較高園林應(yīng)用價值的品種，推廣應(yīng)用播種、扦插、分株、組培等技術(shù)，并總結(jié)了野生植物在園林應(yīng)用中的優(yōu)缺點。

野生植物具有抗寒、抗旱、抗鹽堿、抗病蟲害等抗性強的優(yōu)點及節(jié)水、節(jié)省勞動力等優(yōu)勢，既能降低綠化成本，又能減少外來苗木對本地生態(tài)平衡的影響。但野生植物觀賞性較差，制約了其在園林綠化中的推廣應(yīng)用。因此，改良和培育具有本地特色，適應(yīng)本地自然條件，擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的鄉(xiāng)土野生觀賞植物新品種，成為新的研究方向。

1 試驗材料

1.1 受體植物——興安石竹（）(見圖1）

圖1 興安石竹

受體植物是呼和浩特市園林科研所“野生植物研究課題組”2006 年9 月從大青山呼和浩特段采集并引種馴化的野生植物。興安石竹花朵數(shù)量多、種子數(shù)量大、柱頭便于操作，可作為花粉管導(dǎo)入總DNA 試驗的材料。

1.1.1 生物學(xué)特性。興安屬石竹科石竹屬草本植物，株高20～40cm，成苗冠徑40cm 左右。莖基部簇生，葉披針狀條形或條形，花邊緣有不整齊齒裂，花色呈紅紫色、粉紅色、白色，雌蕊2 個，雄蕊較多，花期6-9 月，果期8-10 月，野生種子發(fā)芽率達75%，千粒重0.42g，播種當(dāng)年可開花。

1.1.2 優(yōu)缺點及改良目標。興安石竹優(yōu)點是抗逆性強、節(jié)水、耐旱，株型豐滿，著花數(shù)量和單花種子數(shù)量多，植株高度整齊，當(dāng)年開花，花色鮮艷。缺點是植株會出現(xiàn)自然退化現(xiàn)象。改良目標是延遲或改變退化現(xiàn)象，豐富花色、花形。

1.2 供體植物——剪秋蘿（紅色）（（見圖2）

圖2 剪秋蘿

供體植物選自呼市植物園內(nèi)，與受體植物是同科不同屬植物。

1.2.1 生物學(xué)特性。剪秋羅別名大花剪秋羅，屬石竹科剪秋羅屬植物，為多年生草本植物。高50～80cm，莖直立，葉片呈卵狀長圓形或卵狀披針形，二歧聚傘花序，花瓣深紅色，蒴果為長橢圓狀卵形，花期6-7 月、果期8-9 月。

1.2.2 優(yōu)缺點及改良目標。剪秋羅優(yōu)點是花色顯眼，株型直立、健壯，缺點是株型冠徑小、分枝和著花數(shù)量少、花朵小，改良目標是株型豐滿、分枝多、花朵大、著花數(shù)量多。

2 試驗方法

2.1 花粉管通道法[2-3]

花粉管通道法轉(zhuǎn)化技術(shù)以DNA 片段雜交假說為理論基礎(chǔ)，1979 年由我國學(xué)者周光宇提出。主要原理是利用植物受粉后形成的天然花粉管通道（花粉引導(dǎo)組織），將外源DNA 片段整合進受體基因組中，達到遺傳轉(zhuǎn)化的目的，這一技術(shù)原理可應(yīng)用于任何開花植物?；ǚ酃芡ǖ婪▽?dǎo)入的方法有：柱頭滴加法、花粉粒攜帶法、子房注射法等[1-2]，本研究采用柱頭滴加法。

2.1.1 影響DNA 花粉管導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化的因素[4]。（1）供體DNA 質(zhì)量要求：花粉管導(dǎo)入法對導(dǎo)入的供體DNA 片段的大小及純度都有較高要求，在DNA 的純化過程中，既要保持DNA 片段的完整性，又要去除蛋白質(zhì)或RNA 等雜質(zhì)的干擾。（2）供體DNA 的濃度和注入量：不同的植物花器各不相同，適宜的DNA 濃度和量也不同。根據(jù)植物的花器特點和試驗摸索，以受體花器不受損害為前提，確定最佳濃度范圍和用量，一定范圍內(nèi)隨供體DNA濃度的增加，注入量增大，則轉(zhuǎn)化率越高。（3）供體DNA導(dǎo)入時期：根據(jù)花粉管通道法導(dǎo)入原理，最適宜的導(dǎo)入時期應(yīng)限定在精卵融合至合子分裂前這一段時間，即以花粉管延伸到胚囊后開始導(dǎo)入為宜。（4）其他因素：理論上可不考慮供體和受體的親緣關(guān)系，但一般供體與受體同源性高，其DNA 片段較易整合到受體染色體上，選擇最適合的導(dǎo)入方法也是影響轉(zhuǎn)化的因素。此外，操作技術(shù)及環(huán)境因素也會對DNA 的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響。

2.1.2 花粉管通道法的優(yōu)點[5-6]。操作簡單，在溫室、大田或盆栽中都可進行；利用整體植株的受精卵、卵細胞或早期胚細胞進行轉(zhuǎn)化，可直接根據(jù)目標性狀的表現(xiàn)進行篩選；縮短育種時間；不受基因型影響；適合所有開花植物。

2.1.3 花粉管通道法的缺點[5-6]。操作過程中易受環(huán)境條件影響；整合不穩(wěn)定，會引起性狀的大量分離，需經(jīng)過多代的自交純化，才能得到目標性狀純合穩(wěn)定的后代；轉(zhuǎn)化率較低，約為1%，轉(zhuǎn)基因表達效率低，轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生非期望變異多，變異具有隨機性、廣泛性；操作經(jīng)驗性強，需不斷探索技巧；只局限于開花時期。

2.2 試驗步驟

首先，觀察受體植物花型信息，觀察單花狀態(tài)及花開不同時期，雌蕊柱頭的變化，確定最佳授粉時間。其次，通過采集受體植物花粉進行離體培養(yǎng)，測定花粉管生長速度，同時，參考相關(guān)文獻資料，確定總DNA 導(dǎo)入時間、濃度及導(dǎo)入量。

2.2.1 受體植物——興安石竹單花狀態(tài)及柱頭的觀察。由表1 和圖3 可知，從花開狀態(tài)2（即花瓣包合，伸出萼片0.5cm）開始就可授粉，這時柱頭發(fā)亮、凸起、黏液逐漸增多。單花從包合狀態(tài)到完全開放需10d，到花瓣枯萎需15d，到種子成熟需28d。

表1 興安石竹單花狀態(tài)及柱頭、花藥的觀察結(jié)果

圖3 興安石竹4 種開花狀態(tài)及柱頭、花藥

2.2.2 供體植物總DNA 的提取。取剪秋蘿嫩葉若干克，采用TIANGEN 植物基因組DNA 提取試劑盒和CTAB法，提取供體植物總DNA。

2.2.3 DNA 純度和濃度的測定。用DNA 濃度測量儀測定，OD260∶OD280 比值應(yīng)為1.7∶1.9，比值過高則純度不高。濃度調(diào)整可用真空濃縮儀和ddH2O 稀釋以達到所需濃度。

2.2.4 提取供體植物總DNA 的濃度和體積（見表2）。

表2 提取供體植物總DNA 的濃度和體積

圖4 導(dǎo)入DNA 套袋

圖5 導(dǎo)入DNA 結(jié)種

3 結(jié)果與分析

將不同濃度剪秋蘿的總DNA 導(dǎo)入到興安石竹的試驗中，采收到種子數(shù)量結(jié)果（見表3）。

表3 不同濃度的總DNA 導(dǎo)入后采收的種子數(shù)量

2013 年收到266 粒種子，其中部分不飽滿，播種后有少量發(fā)芽，觀察植株生長及開花情況，發(fā)現(xiàn)有3 株在花朵上有明顯變化（見圖6）。

圖6 子一代變異與原花對比

變異1：花朵中央的環(huán)形花紋消失，葉形、株形無變化。變異2：花朵中央的環(huán)形花紋消失，花瓣出現(xiàn)輻射狀白色條紋，且花瓣形狀有變化，基部變窄，使花瓣間分離，葉形、株形無變化。變異3：花瓣形狀有變化，基部變窄，使花瓣間分離，葉形、株形無變化。第2 年，觀察采收的變異植株種子播種情況，發(fā)現(xiàn)變異全部消失，且母株變異也基本消失（見圖7）。

圖7 變異興安石竹第2 年

由上述試驗可知，用花粉管導(dǎo)入法導(dǎo)入外源總DNA 較易獲得變異植株，但不一定是目標變異，變異具有隨機性，要想獲得目標變異，需做大量的工作和一定的機遇，同時，DNA 整合具有不穩(wěn)定性。2014 年調(diào)整濃度，以100ng/μL、300 ng/μL、500ng/μL 濃度梯度5μL滴加于花柱斷面上，結(jié)果只有300ng/μL 濃度梯度的結(jié)種子，考慮因為500ng/μL 濃度梯度過高而損傷花器，100ng/μL 濃度梯度人為操作不當(dāng)，導(dǎo)致不結(jié)種子，采收的種子需進行播種并觀察是否有變異。現(xiàn)有結(jié)果可以說明，花粉管導(dǎo)入法導(dǎo)入外源總DNA 可獲得轉(zhuǎn)化的種子和植株，若要獲得目標變異性狀，需要時間和機遇。

4 結(jié)語

（1）了解和掌握受體植物的生殖、生理及物候期特性，在不考慮轉(zhuǎn)化率的前提下，采取柱頭切割方式，導(dǎo)入總DNA 的方法、濃度和時間及實踐操作技術(shù)都會直接影響結(jié)種。因此，優(yōu)化技術(shù)參數(shù)是導(dǎo)入成功與否和提高導(dǎo)入效率的前提條件，也是外源DNA 片斷能否整合到受體基因組的因素之一。目前，還沒有關(guān)于野生植物為受體技術(shù)參數(shù)方面的報道，同科屬種的栽培種只可作為參考和借鑒，導(dǎo)入的手段和技術(shù)參數(shù)還需在實踐中摸索總結(jié)和優(yōu)化。

（2）在實際操作技術(shù)方面，柱頭滴加溶液時，因?qū)胍后w的表面張力使DNA 溶液不容易滲入，興安石竹的柱頭小，采用反復(fù)滴加后套袋。柱頭切割要在不損傷花器的前提下盡可能短截，以減少外源DNA 導(dǎo)入的路徑，試驗中得出結(jié)論是在柱頭1cm 以下切割1/2 較合適。此外，采用柱頭斜切、負壓處理、浸漬吸收等措施，都會有助于外源DNA 溶液的滲入，從而提高導(dǎo)入率。

（3）滴加外源DNA 總量和濃度與受體花的大小有一定關(guān)系，滴加外源DNA 總量和濃度采用高濃度時，要減少滴加量，濃度過高會損傷花器，而進行反復(fù)滴加時則用低濃度。

（4）不同植物種類導(dǎo)入DNA 時機大不相同，基本無規(guī)律可循，同時，花粉萌發(fā)、花粉管進入胚囊及受精過程會因自然條件，如氣候、溫度、濕度等的變化而有差異。只有當(dāng)花粉管生長到花柱底部，到形成具有正常細胞壁的合子之前的這一段時間導(dǎo)入才有可能被整合，因此，在實際操作中要綜合考慮，適時調(diào)整。

通過花粉管導(dǎo)入總DNA 的方法較多，如花粉管通道法、子房注射法、外源DNA 直接涂抹法、花粉勻漿涂抹柱頭法、外源DNA 溶液浸泡花粉授粉法等，不同的方法各有特點，應(yīng)根據(jù)受體植物的花器特點考慮最佳導(dǎo)入方法。

本研究以野生植物作為受體，也可以用野生植物作為供體，導(dǎo)入栽培種植物中，可增強栽培種抗逆性，從而獲得優(yōu)良新品種。