發(fā)酵液中alpha-酮戊二酸的提取

裴 瑩，孫玉波，黃 斌

(四川理工學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院 化學(xué)工程系，四川 自貢 643000)

0 引言

alpha-酮戊二酸(α-酮戊二酸，又α-KG)分子式為C5H6O5，是一種白色、無嗅細(xì)結(jié)晶性粉末，易潮解，易溶于醇、水、 極難溶于醚.alpha-酮戊二酸是一種重要的短鏈羧酸分子，是微生物細(xì)胞中三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle，TCA cycle)中連接碳代謝和氮代謝重要的代謝中間產(chǎn)物，能表征細(xì)胞中的碳-氮平衡水平，在機(jī)體內(nèi)參與氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素的合成并調(diào)控多種能量代謝，是一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)，在各個(gè)領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用價(jià)值[1,2].alpha-酮戊二酸可以減輕腎病患者的腎臟負(fù)擔(dān)、促進(jìn)患者手術(shù)后快速恢復(fù)和減少并發(fā)癥，因此在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值；alpha-酮戊二酸能迅速幫助人體補(bǔ)充能量，恢復(fù)人體機(jī)能，因此在食品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景；此外，alpha-酮戊二酸因?yàn)槠涮厥獾幕瘜W(xué)性質(zhì)還廣泛應(yīng)用于化學(xué)有機(jī)合成領(lǐng)域[2].

目前，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)alpha-酮戊二酸成為最佳選擇，也成為研究熱點(diǎn)和主要生產(chǎn)方法[2].但是，由于發(fā)酵液中存在雜菌、丙酮酸、鹽類等雜質(zhì)，且其中alpha-酮戊二酸的含量低，因此在發(fā)酵液中提取alpha-酮戊二酸難度較大，到目前為止報(bào)道的只有沉淀法和離子交換法兩種方法從發(fā)酵液中提取alpha-酮戊二酸.但是沉淀法的收率低，工藝過程較復(fù)雜，在實(shí)際生產(chǎn)過程中受到限制；而離子交換法的投資操作費(fèi)用高，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生廢酸或廢堿等，因此本研究的目的在于找到一種恰當(dāng)?shù)姆椒▉矸蛛x、提純發(fā)酵液中的alpha-酮戊二酸.目前較為理想的方法為雙水相萃取.

雙水相體系是指在水溶液中加入與水混溶的有機(jī)溶劑(如丙酮)和無機(jī)鹽(如磷酸氫二鉀)使互溶的兩相分離，其中一相富含有機(jī)物，另一相富含無機(jī)鹽.它的形成機(jī)制從溶液理論來說，取決于混合時(shí)的熵變和分子間的相互作用力.雙水相萃取技術(shù)是新型分離技術(shù)，日益受到人們的重視，與傳統(tǒng)的萃取分離技術(shù)相比具有含水量高、操作條件溫和、界面張力低、分離迅速、分離提純效率高、過程易于放大、易于連續(xù)操作、成本低、低毒性等特點(diǎn)，因此在生物工程、天然藥物和生物活性物質(zhì)的分離提取方面有著廣泛的應(yīng)用[3].并且目前國內(nèi)外鮮有對(duì)雙水相萃取發(fā)酵液中alpha-酮戊二酸的相關(guān)研究，基于此，本研究主要采用無機(jī)鹽-低分子有機(jī)溶劑形成的雙水相體系[4]萃取發(fā)酵液中的alpha-酮戊二酸.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-酮戊二酸發(fā)酵液(葡萄糖發(fā)酵液、甘油發(fā)酵液)，四川龍蟒福生科技有限責(zé)任公司；丙酮 ，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；磷酸氫二鉀(三水)，成都市科龍化工試劑廠；α-酮戊二酸(含量≥99%)，上海源葉生物科技有限公司.試驗(yàn)用試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平Scout SE，奧豪斯儀器(常州)有限公司；循環(huán)水式真空泵SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市儀器予華儀器有限責(zé)任公司；電熱恒溫水浴鍋DK-98-Ⅱ，天津市泰斯特儀器有限公司；雙光束紫外可見光分光光度計(jì)DH-2000-BAL，美國海洋光學(xué)公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱DHG-9070A，常州普天儀器制造有限公司.

1.3 方法

1.3.1 雙水相萃取基本原理

雙水相萃取是利用物質(zhì)在互不相溶的兩個(gè)水相之間分配系數(shù)的差異實(shí)現(xiàn)分離的分離方法.由于萃取體系的性質(zhì)不同，在被分離物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于分子間的范德華瓦爾斯力、疏水作用、分子間的氫鍵、分子與分子之間電荷作用的存在和環(huán)境因素的影響，使其在靜置分層時(shí)被分離物質(zhì)在兩相中的濃度不同，然后將富集了被分離成分的相分離出來，再經(jīng)過處理后就可得到被分離成分，從而達(dá)到分離的目的[5].

低分子有機(jī)溶劑-無機(jī)鹽雙水相體系成相的基本原理是鹽相、有機(jī)相與水分子締合競爭，形成締合水合物[5].溶質(zhì)在雙水相體系中服從Nernst分配定律，溶質(zhì)在兩相中濃度比等于常數(shù)，分離效果由分配系數(shù)來表征，它涉及表面性質(zhì)(表面自由能)、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)等，使其在上、下相中的濃度不同[6].

相關(guān)計(jì)算公式如下：

式中：K為分配系數(shù);Ct和Cb分別為alpha-酮戊二酸在雙水相體系上、下兩相中的濃度，g/L；R為相比；Vt和Vb分別為雙水相體系上、下相的體積，mL；E為alpha-酮戊二酸的萃取效率.

1.3.2 雙水相體系的相圖繪制

水溶液兩相的形成條件和定量關(guān)系常用相圖來表示，它是一條雙界線，當(dāng)兩相的組成位于曲線的上方時(shí)體系就會(huì)分成兩相.采用濁度法[7,8]繪制丙酮/K2HPO4·3H2O雙水相體系的相圖，確定合適的雙水相體系(見圖1).由圖1可以看出，K2HPO4·3H2O與丙酮形成的穩(wěn)定的雙水相體系，所需丙酮量較少且成相范圍較寬.

圖1 丙酮/K2HPO4·3H2O雙水相體系相圖Fig. 1 acetone/K2HPO4·3H2O aqueoustwo-phase system phase diagram

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用雙光束紫外可見光分光光度計(jì)，測(cè)定alpha-酮戊二酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值，確定最佳吸收波長為235.14 nm，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為C=1.8239A+0.0128(R2=0.999)，alpha-酮戊二酸溶液在0.005～0.250 g/L的范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸光度呈線性關(guān)系.

1.3.4 實(shí)驗(yàn)方法

按質(zhì)量配制一定比例的雙水相體系，系統(tǒng)總量為40 g(其中發(fā)酵液添加量為25%，10 g).加入10 g發(fā)酵液與之混合，攪拌均勻，形成上、下相，靜置10 min后分液，讀取上、下相體積并分別進(jìn)行減壓蒸餾除去丙酮，測(cè)定上、下相中alpha-酮戊二酸的吸光值，計(jì)算分配系數(shù)、相比和萃取率[9].采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法探討萃取過程中各因素對(duì)alpha-酮戊二酸萃取率的影響，并確定最佳的提取分離工藝條件[10].

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相體系中磷酸鹽加入量的確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，alpha-酮戊二酸的分配系數(shù)(K)隨著體系中磷酸鹽加入量的增大呈下降趨勢(shì)，原因是隨著鹽相用量的增大，其競爭締合水分子的能力增強(qiáng)，導(dǎo)致上相中更多的水分被競爭吸附到下相中，使上相體積減小，相比減小，而水分會(huì)帶動(dòng)一部分alpha-酮戊二酸進(jìn)入下相，使上相中alpha-酮戊二酸濃度降低，下相濃度上升，從而導(dǎo)致alpha-酮戊二酸在兩相的分配系數(shù)降低，萃取率(E)降低.在K2HPO4·3H2O加入量為6 g時(shí)，alpha-酮戊二酸的萃取率達(dá)到了最高，為85.39%.根據(jù)實(shí)驗(yàn)和相圖可知，磷酸鹽加入量不能低于6 g，否則將不能成相.

圖2 K2HPO4·3H2O用量的影響Fig. 2 Effects of dipotassium hydrogen phosphate trihydrate dosage

2.2 雙水相體系中丙酮加入量的確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，alpha-酮戊二酸的分配系數(shù)隨著體系中丙酮加入量的增大而減小，原因是隨著有機(jī)相用量的增大，親水性有機(jī)溶劑丙酮競爭水分子的能力增強(qiáng)，使下相中更多的水分被競爭吸附到上相，同時(shí)，上相中的部分有機(jī)溶劑被擠入到下相中，使得兩相的相比基本不變，所以上相中的alpha-酮戊二酸被稀釋，alpha-酮戊二酸在上相的濃度降低，在下相的濃度增加，使得分配系數(shù)降低，從而導(dǎo)致萃取率降低.所以在丙酮加入量為8 g時(shí)，萃取率最高，為87.30%.

圖3 丙酮用量的影響Fig. 3 Effects of acetone dosage

2.3 萃取溫度的確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，alpha-酮戊二酸的分配系數(shù)隨著萃取溫度的升高，呈先上升后下降的趨勢(shì).通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)相比的影響不大，當(dāng)溫度升高時(shí)，alpha-酮戊二酸在上、下相的溶解度都會(huì)增大，且其在上相有機(jī)溶劑中的溶解度比在下相水中的大，使分配系數(shù)增加，有利于萃取，但是隨著溫度持續(xù)升高，分子運(yùn)動(dòng)加劇，部分alpha-酮戊二酸分子進(jìn)入到下相中，使得alpha-酮戊二酸在上相的濃度降低，在下相的濃度增加，使得分配系數(shù)降低，萃取率降低.并且溫度升高，體系中各分子間的相互作用加強(qiáng)，影響相界面間的傳質(zhì)以及體系的穩(wěn)定性，不利于被分離物質(zhì)的選擇性分配，對(duì)萃取不利.但溫度也不宜過低，溫度降低，分子運(yùn)動(dòng)減弱，影響體系成相過程，使分相時(shí)間增加.故選擇20 ℃～30 ℃的溫度進(jìn)行萃取比較適宜.

圖4 萃取溫度的影響Fig. 4 Effects of extraction temperature

2.4 最佳雙水相體系的確定及驗(yàn)證

系統(tǒng)總量40 g，以丙酮(A,g)、K2HPO4·3H2O(B,g)和萃取溫度(C,℃)為3因素進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，因素水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果及計(jì)算見表2.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab. 1 Factors and their coded levels inorthogonal array design

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab. 2 Orthogonal array design andcorresponding experimental results

由表1、表2可知，各因素對(duì)alpha-酮戊二酸萃取率的影響大小為：B>C>A；最佳工藝條件為A3B1C3，即丙酮9.6 g，K2HPO4·3H2O 6 g，萃取溫度30 ℃.以最佳工藝條件進(jìn)行3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)處理取均值得：相比R=2.5，分配系數(shù)K=2.75，萃取率E=87.56%.由此可見，在最佳工藝條件下，丙酮/K2HPO4·3H2O雙水相體系對(duì)alpha-酮戊二酸具有比較穩(wěn)定且較好的分離提純效果.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過雙水相體系萃取alpha-酮戊二酸，主要研究了丙酮用量、K2HPO4·3H2O用量和萃取溫度對(duì)alpha-酮戊二酸分配系數(shù)和萃取率的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了系統(tǒng)試驗(yàn)，確定了一種比較穩(wěn)定的雙水相萃取體系.利用丙酮/K2HPO4·3H2O雙水相體系提取分離alpha-酮戊二酸，系統(tǒng)總量為40 g，丙酮用量9.6 g，K2HPO4·3H2O用量6 g，萃取溫度30 ℃，相比為2.5，分配系數(shù)為2.75，萃取率可達(dá)到87.56%.采用丙酮/K2HPO4·3H2O雙水相體系萃取分離alpha-酮戊二酸，其萃取效率較好，這種低分子有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽的新型雙水相體系分離時(shí)間短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，且在后續(xù)工藝中兩相物質(zhì)易回收、資源可重復(fù)利用，很大程度上節(jié)約了成本.并且用這種新型雙水相體系萃取alpha-酮戊二酸還未見有報(bào)道，我們還可以進(jìn)一步地深入探討.