稀土釤離子與牛血清白蛋白相互作用研究

呂艷陽，張文生，袁廣勝，陳越超，葉盈珊

(1.信陽師范學院 化學化工學院，河南 信陽 464000；2.中山紀念中學，廣東 中山528454)

0 引言

隨著稀土在農業(yè)及醫(yī)學上應用的不斷擴大，稀土離子與生物大分子的相互作用及對生物大分子結構和功能方面的影響日益受到重視.蛋白質是一種含多個配位基團的生物大分子，其生物功能與其特定結構密切相關.稀土進入人體內與蛋白質發(fā)生作用，會影響甚至改變蛋白質分子固有的結構和功能.因此研究稀土與蛋白質的相互作用對于了解稀土離子在體內的代謝過程及生物效應的作用機理有實際而深遠的意義[1].

牛血清白蛋白與內源性化合物、藥物分子及許多金屬離子如Cu2+、Ni2+、Ca2+、Zn2+、Cd2+、Mn2+、Co2+和Cr2+等的相互作用已進行了較為廣泛的研究[2-5].但與稀土金屬離子作用的研究較少.本文用熒光光譜法研究了稀土金屬Sm3+離子與BSA的相互作用，為進一步探究稀土離子在生物無機化學、藥化學等領域的研究提供一些理論和應用價值方面的信息.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：Cary Eclipse熒光分光光度計，美國瓦里安公司；HH-2恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；精密pH計，上海雷磁有限公司；電子分析天平，上海菁海儀器有限公司.

試劑：BSA溶液，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；三氧化二釤(Sm2O3)，分析純，天津市光復精細化工研究所；Tris(三羥甲基氨基甲烷)固體粉末，分析純，天津市凱通化學試劑有限公司；鹽酸溶液(6 mol/L)，北京中諾泰安科技有限公司.

1.2 溶液的配制

配制8×10-6mol/L的BSA：用分析天平準確稱量0.052 g BSA固體粉末，加蒸餾水使之完全溶解，然后定容至100 mL容量瓶中.

配制不同pH值(6.5、7.5、8.5)Tris-HCl緩沖溶液:先配制0.1 mol/L Tris溶液，即用分析天平準確稱量3.029 g Tris(三羥基甲基甲烷)固體粉末，加蒸餾水使之完全溶解，然后移至250 mL容量瓶中(Tris稱兩份，溶解至兩個250 mL容量瓶).取配制好的0.1 mol/L的Tris溶液，使其體積為V≥120 mL(夠用就好，120 mL左右，取三份).然后用精密pH計(帶磁力攪拌器)向其中加6 mol/L的鹽酸溶液分別配制pH值為6.5、7.5、8.5的Tris-HCl緩沖溶液.

配制0.1 mmol/L的Sm3+標準溶液：用分析天平準確稱量1.25 mg三氧化二釤固體粉末，用6 mol/L的鹽酸溶液在HH-2恒溫水浴鍋條件下溶解，然后定容轉移至100 mL容量瓶中.

1.3 實驗方法

取8支10 mL刻度比色管，加入2.0 mL 8×10-6mol/L的BSA溶液和不同體積的Sm3+標準溶液，分三組，分別用pH值為6.5、7.5、8.5 Tris-HCl緩沖溶液定容至10 mL刻度線處，固定激發(fā)波長為280 nm，記錄282～500 nm范圍的熒光發(fā)射光譜.實驗室激發(fā)狹縫10 nm而發(fā)射狹縫為5 nm，測定熒光光譜.

2 結果與討論

2.1 不同Sm3+離子濃度對BSA熒光光譜的影響

按1.3實驗方法設1號比色管為空白對照組(2 mL BSA，8 mL Tris-HCl)，2～8號比色管先加入2 mL BSA，然后分別加入50、100、150、200、250、300、350 μL的1×10-4mol/L Sm3+標準溶液，再用pH值6.5的Tris-HCl緩沖溶液定容至10 mL刻度線處.掃描Sm3+與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜圖，結果見圖1.

同上，改變Sm3+標準溶液的濃度范圍，再用pH值7.5的Tris-HCl緩沖溶液定容至10 mL刻度線處.掃描Sm3+與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜圖，結果見圖2.

同上，改變Sm3+標準溶液的濃度范圍，再用pH值8.5的Tris-HCl緩沖溶液定容至10 mL刻度線處.掃描Sm3+與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜圖，結果見圖3.

圖1 緩沖溶液pH值為6.5時Sm3+與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜Fig. 1 Fluorescence emission spectra ofSm3+ and BSA(pH=6.5)圖中從a到f曲線：往BSA中加入的Sm3+離子濃度依次為0、0.5×10-5、1.0×10-5、1.5×10-5、2.0×10-5、2.5×10-5、3.0×10-5、3.5×10-5 mol/L

圖2 緩沖溶液pH值為7.5時Sm3+與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜Fig. 2 Fluorescence emission spectra ofSm3+ and BSA(pH=7.5)圖中從a到f曲線：往BSA中加入的Sm3+離子濃度同圖1

圖3 緩沖溶液pH值為8.5時Sm3+與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜Fig. 3 Fluorescence emission spectra ofSm3+ and BSA(pH=8.5)圖中從a到f曲線：往BSA中加入的Sm3+離子濃度同圖1

由圖1、圖2、圖3可以看出，在選定的Sm3+濃度范圍內，Sm3+對BSA的熒光均產生了猝滅，且其熒光強度隨著Sm3+濃度的增加而降低.

2.2 稀土Sm3+離子與BSA的相互作用的探究

往BSA中加入稀土Sm3+會產生熒光強度降低的現象，這是因為熒光物質與其他溶劑分子或溶質分子的相互作用而產生猝滅.故稀土Sm3+離子與BSA的相互作用使熒光強度降低也屬于熒光猝滅.發(fā)生熒光猝滅的原因很多，主要有靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅.動態(tài)猝滅也稱為碰撞猝滅[4].處于單重態(tài)的熒光分子與猝滅劑發(fā)生反應后，生成沒有熒光的基態(tài)復合物.而靜態(tài)猝滅則是指部分熒光物質分子與猝滅劑分子相互作用生成非熒光的絡合物，故而靜態(tài)猝滅也稱為組合化合物的猝滅.

牛血清白蛋白的內源熒光是由分子中色氨酸殘基和絡氨酸殘基引起的，稀土Sm3+離子的加入能使其熒光規(guī)律性猝滅.熒光猝滅過程有動態(tài)和靜態(tài)之分，動態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光劑激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用過程，遵從Stern-Volmer方程[5]：

F0/F=1+Kqτ0C=1+KsvC,

(1)

式(1)中:F0/F指未加入猝滅劑與加入猝滅劑后的相對熒光強度.Kq是指猝滅速率常數.τ0是不含有猝滅體時熒光體的熒光壽命[3](對于大多數的生物分子τ0多為10-8s).Ksv為Stern-Volmer猝滅常數.Ksv的大小表示稀土Sm3+離子與BSA間的作用強弱.

綜上所述，根據Stern-Volmer方程，在Tris-HCl緩沖溶液pH值為6.5、7.5、8.5的情況下測定熒光發(fā)射光譜在350 nm波長的相對熒光強度為F，以F0/F為縱坐標，以添加的Sm3+溶液的濃度C為橫坐標作圖，得出稀土Sm3+離子與BSA的Stern-Volmer猝滅曲線，如圖4所示.

圖4 不同pH值時Sm3+離子對BSA的熒光猝滅Stern-Volmer圖Fig. 4 Fluorescence emission spectra of Sm3+and BSA at different pH values

從圖1、圖2、圖3和圖4可知，隨著加入的Sm3+離子的濃度的增大，整個體系的熒光發(fā)射峰逐漸降低，此時Sm3+離子與BSA可能在基態(tài)時生成了不發(fā)光的復合物，從而導致了熒光強度的降低，產生了猝滅效果.

為確認Sm3+離子對BSA熒光猝滅的機理，按照圖1、圖2、圖3中曲線在λex= 350 nm出的熒光強度及處理圖4的數據，利用式(1)對各實驗結果進行處理，結果如表1所示.

表1 Sm3+離子對BSA的熒光猝滅常數Ksv和雙分子猝滅過程常數Kq

查詢資料，各類猝滅劑對生物大分子最大擴散控制的碰撞猝滅常數是2.0×1010L·mol-1·s-1,本文得到的Kq遠大于這一數值.說明了Sm3+離子對BSA的熒光猝滅不是動態(tài)猝滅，而是形成復合物所引起的靜態(tài)猝滅[6].

2.3 稀土Sm3+離子與BSA的結合常數Ka和結合數n

在靜態(tài)猝滅中，利用何錫文等[7]推導的公式(2)求出結合常數Ka和結合位數n:

lg[F/(F0-F)]=-lgKa-nlg[Q],

(2)

式(2)中：F0、F同樣指的是猝滅劑與無猝滅劑時的熒光強度，Ka是BSA與稀土Sm3+離子的結合常數，[Q]是猝滅劑的平衡濃度，n是結合數.由圖4和表1可以得出：pH值為7.5時擬合直線方程線性關系最好.pH 7.5時擬合的線性方程為：

lg[F/(F0-F)]= -5.945 -1.22 lg[Q],

R= 0.997.

則Ka= 9.652×105L·mol-1,結合數n= 1.22.

2.4 稀土La3+和Ce3+離子與BSA的結合常數Ka和結合數n

本文也研究了另外兩種稀土離子La3+和Ce3+與BSA相互作用的熒光光譜，發(fā)現它們對BSA的熒光同樣產生了靜態(tài)猝滅，只是強度稍弱，pH值為7.5時結合常數Ka= 9.3×104L·mol-1、結合數n= 1.15.

3 結論

本文通過對稀土Sm3+離子與BSA相互作用的熒光光譜的研究，可以發(fā)現Sm3+離子對BSA有良好的熒光猝滅作用，并且猝滅過程為靜態(tài)猝滅.通過比較可知，Tris-HCl緩沖溶液pH值為7.5時，向濃度為8×10-6mol/L的BSA溶液加入不同濃度的Sm3+離子時，其猝滅過程速率常數Kq= 4.12×1012L·mol-1·s-1、結合常數Ka= 9.652×105L·mol-1和結合數n= 1.22.該結果為進一步探究稀土離子在生物無機化學、藥化學等領域的研究具有應用價值.