蛭石引發(fā)對NaCl脅迫下番茄種子活力及生理生化指標的影響

霍文雨，吳凌云，姚東偉，李 明，朱月林

(1南京農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，江蘇 南京210095；2上海市農(nóng)業(yè)科學院 設施園藝研究所 上海市設施園藝技術重點實驗室，上海201403)

番茄(LycopersiconesculentumM.)是世界上重要的蔬菜作物之一，也是植物遺傳學及茄科作物研究常用的模式植物。種子快速、整齊發(fā)芽和田間出苗對番茄產(chǎn)量與品質(zhì)具有重要意義。種子活力表征種子發(fā)芽和種胚是否具有生命力的潛在能力，決定著種子快速、整齊出苗并形成正常幼苗的能力，是檢測種子質(zhì)量的一個重要指標，其性狀往往表現(xiàn)在種子發(fā)芽、幼苗生長、種子壽命、耐逆性等方面[1]。有關種子引發(fā)在延長種子壽命[2]、促進脅迫下種子發(fā)芽[3]等方面的作用均有報道。以往研究發(fā)現(xiàn)，PEG引發(fā)能延長番茄種子壽命[4]，水引發(fā)能提高種子萌發(fā)期間的耐旱性[5]；且不同的引發(fā)物質(zhì)在番茄上表現(xiàn)不同，如PEG和 KNO3+K2HPO4以及NO能提高耐冷性[6]，NaCl引發(fā)能提高耐鹽性[7]，KNO3引發(fā)能提高發(fā)芽率[8]等。蛭石引發(fā)也是常用的引發(fā)方式，其能提高莖用萵苣[9]、小白菜的耐高溫特性[10]，提高甜玉米的出苗率[11]及耐低溫特性[12]。番茄生產(chǎn)中，由于不同個體間種子活力存在差異，因此往往難以實現(xiàn)種子整齊發(fā)芽和出苗速度的一致性；此外，番茄屬于中度耐鹽作物，種子萌芽期和幼苗期對鹽脅迫比較敏感，因此能否在鹽脅迫條件下健康成苗是其正常生長發(fā)育的關鍵；同時，隨著溫室大棚等設施栽培方式的普及，由于其環(huán)境條件密閉，長期無降雨淋溶，施用的大量礦質(zhì)肥料不能隨雨水淋溶到土壤深層，造成耕作層土壤鹽分聚集，且溫室灌水施肥頻繁，耕層土壤濕度較大，土壤團粒結構受到破壞，土壤滲透能力降低，鹽分無法滲透到土壤深層，因此水分蒸發(fā)后鹽分積聚于土壤表層，造成土壤鹽害。而土壤鹽害給番茄種子的萌發(fā)帶來了巨大威脅[13]，培育高活力耐鹽番茄品種是解決上述問題的最有效方法，但培育難度大，且費時費力，因此有必要研發(fā)一種低成本、高效率的種子處理技術，以提高番茄種子在鹽脅迫下的活力。本試驗以番茄雜交種子為材料，研究了蛭石引發(fā)處理對番茄種子發(fā)芽、氧化及生理特性的影響，分析其對番茄種子萌發(fā)與種子在吸脹期及幼苗期耐鹽性的影響，旨在為探究番茄的耐鹽生理機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2個供試雜交一代番茄品種‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’，均由上海長種番茄種業(yè)有限公司提供。引發(fā)蛭石由新疆尉犁新隆有限責任公司提供。

1.2 種子引發(fā)

根據(jù)預試驗結果，將種子經(jīng)質(zhì)量分數(shù)0.1% HgCl2表面消毒5 min后，按照種子和蛭石1∶1.5的質(zhì)量比混合，再加入兩者質(zhì)量70%的蒸餾水，攪拌均勻置于燒杯中，15 ℃黑暗條件下引發(fā)5 d，每天進行攪拌。引發(fā)結束后，用蒸餾水將種子沖洗干凈，用濾紙吸干種子表面水分，28 ℃回干2 d，直至種子含水量與引發(fā)前一致,再進行發(fā)芽試驗。

1.3 種子發(fā)芽試驗

試驗于2017年2-4月在上海市農(nóng)業(yè)科學院設施園藝技術重點實驗室微氣候室進行。培養(yǎng)箱內(nèi)溫度25 ℃，光照12 h，光強4 000 lx，相對濕度70%。將引發(fā)和未引發(fā)的番茄種子放入裝有0(CK)，100 mmol/L NaCl及2層濾紙的消毒發(fā)芽盒(13 cm×19 cm×16 cm)內(nèi)，發(fā)芽期內(nèi)每天計數(shù)，以露白為發(fā)芽標準，計算3 d發(fā)芽率、10 d發(fā)芽率(GR)；據(jù)此計算發(fā)芽指數(shù)(GI)、發(fā)芽勢(GP)、平均發(fā)芽時間(MGT)。試驗重復3次。鹽溶液及蒸餾水每天更換1次，保證鹽濃度恒定，防止鹽積累。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 相對電導率的測定 選取健康飽滿無破損的引發(fā)和未引發(fā)種子各0.4 g，置于鋪有2層濾紙的發(fā)芽盒內(nèi)培養(yǎng)，分別加入蒸餾水或100 mmol/L NaCl溶液，在(25±1) ℃人工光照培養(yǎng)箱中吸脹24 h。然后用雙重蒸餾水快速沖洗2遍，用濾紙吸干浮水，將種子放入裝有15 mL雙重蒸餾水的帶塞試管中，恒溫條件下振蕩30 min，測定此時的電導率(EC0)；再置于45 ℃水浴鍋中處理30 min，測定EC1；最后置于100 ℃水浴鍋中處理30 min，測定EC2，相對電導率=(EC1-EC2)/(EC2-EC0)×100%。試驗重復3次。

1.4.2 生理指標的測定 發(fā)芽3 d后，分別取同等質(zhì)量種子測定以下生理指標，各樣品間混合取樣，試驗重復3次。超氧化物歧化酶(SOD)活性參照Giannopolitis等[14]的氮藍四唑(NBT)方法測定；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性參照Nakano等[15]的方法測定；愈創(chuàng)木酚過氧化物酶(G-POD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性均參照Cakmak等[16]的方法測定；MDA含量根據(jù)Heath等[17]的硫代巴比妥酸法測定；α-淀粉酶活性測定采用王學奎[18]的3,5-二硝基水楊酸還原法測定?？扇苄蕴呛坑幂焱壬╗18]測定，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍G-250法[19]測定。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel繪圖，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和Tukey多重比較。

2 結果與分析

2.1 蛭石引發(fā)對NaCl脅迫下番茄種子活力的影響

由表1可知，與對照相比，2個番茄品種‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’未引發(fā)種子在鹽脅迫下發(fā)芽率(GR)分別降低66.67%，64.59%；發(fā)芽指數(shù)(GI)分別降低86.82%，84.42%；發(fā)芽勢(GP)均降低100%；平均發(fā)芽時間(MGT)分別延長4.28，4.19 d。由圖1可知，鹽脅迫下‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’種子在第5天開始發(fā)芽，其發(fā)芽率在第10天分別達到峰值29.33%，34.00%；未脅迫的種子在第2天開始發(fā)芽，其發(fā)芽率在第5天分別達到峰值87.33%，97.33%。對比發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫顯著延遲了種子開始發(fā)芽的時間，且顯著降低了種子的發(fā)芽速度和活力。

表1 蛭石引發(fā)對NaCl脅迫下番茄種子活力的影響Table 1 Effects of solid matrix priming on germination energy of tomato seeds under salt stress

注：1.表中數(shù)據(jù)為“平均值±標準差”，同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示差異達P<5%顯著水平。2.CK+0，P+0分別表示未引發(fā)和引發(fā)種子加水處理；CK+100，P+100分別表示未引發(fā)和引發(fā)種子加100 mmol/L NaCl處理。

Note：The data are “mean±SD”,different lowercase letters represent significant difference atP<5% level.2.CK+0 and P+0 represent non-priming and priming seeds under normal condition;while CK+100 and P+100 represent non-priming and priming seeds under 100 mmol/L NaCl stress.

CK+0，P+0分別表示未引發(fā)和引發(fā)種子加水處理；CK+100，P+100分別表示未引發(fā)和引發(fā)種子加100 mmol/L NaCl處理;下圖同CK+0 and P+0 represent non-priming and priming seeds under normal condition;while CK+100 and P+100 present non-priming and priming seeds under salt stress.The same below圖1 蛭石引發(fā)對NaCl脅迫下2種番茄種子發(fā)芽動態(tài)的影響Fig.1 Effects of solid matrix priming on two tomato seeds germination rate under salt stress

由表1可見，與鹽脅迫下未引發(fā)種子相比，蛭石引發(fā)處理顯著提高了2種番茄種子的GR、GI、GP，‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’分別提高59.15%，52.78%，76.28%和75.81%，100%，100%；而MGT分別縮短1.78和1.88 d。由圖1可知，引發(fā)能縮短種子開始發(fā)芽時間，鹽脅迫下種子在第5天開始發(fā)芽，而引發(fā)條件下種子在第1天即發(fā)芽，顯著提前了種子開始發(fā)芽的時間。但引發(fā)對種子達到發(fā)芽峰值的時間沒有影響。

2.2 蛭石引發(fā)對NaCl脅迫下番茄種子吸脹期間抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，與對照相比，2個番茄品種‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’未引發(fā)種子在鹽脅迫下抗氧化酶活性變化趨勢一致，均表現(xiàn)為顯著降低；其中，CAT活性分別降低43.55%，64.24%；APX活性分別降低30.98%，19.39%；POD活性分別降低37.44%，23.78%;SOD活性分別降低8.08%，18.69%。說明鹽脅迫對番茄種子吸脹期間的抗氧化酶活性有一定的抑制作用。

圖2顯示，在沒有鹽脅迫的情況下，蛭石引發(fā)顯著提高了番茄種子的抗氧化酶活性。其中，‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’CAT活性分別升高19.10%，11.15%；APX活性分別升高15.14%，27.64%；POD活性分別升高20.91%，23.53%；SOD活性分別升高6.24%，2.97%，均達到顯著水平。在鹽脅迫下，2種番茄種子吸脹期間抗氧化酶活性顯著降低，但經(jīng)蛭石引發(fā)后抗氧化酶活性顯著提高。其中‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’CAT活性分別升高29.36%，16.42%；APX活性分別升高18.00%，12.50%；POD活性分別升高32.70%，16.15%；SOD活性分別升高8.63%，10.76%。表明在鹽脅迫下2種番茄種子經(jīng)蛭石引發(fā)后清除自由基速率加快，保護了種子吸脹期間的細胞膜結構，提高了其耐鹽性。

大紅合作909；粉紅合作906；圖柱上不同小寫字母表示同一品種不同處理間達P<5%差異顯著水平；下圖同Red cooperation 909;Pink cooperation 906；Different lowercase letters represent significant different at P<5% level.The same below圖2 蛭石引發(fā)對鹽脅迫下2種番茄種子吸脹期間抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effects of solid matrix priming on the activities of CAT,APX,POD and SOD in two tomato seeds under salt stress

2.3 蛭石引發(fā)對NaCl脅迫下番茄種子吸脹期間EC和MDA含量的影響

由圖3可知，與對照相比，2個番茄品種‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’未引發(fā)種子在鹽脅迫下的EC、MDA含量變化趨勢一致，均顯著升高；其中二者EC升幅分別為31.66%，30.81%；MDA含量升幅分別為38.29%，39.55%。說明鹽脅迫條件下番茄種子吸脹期間脂質(zhì)過氧化程度加深。在沒有鹽脅迫的情況下，蛭石引發(fā)顯著降低了種子的EC、MDA含量，‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’EC分別降低20.64%，22.29%；MDA含量分別降低32.99%，42.41%，均達到顯著水平。鹽脅迫下種子吸脹期間EC、MDA含量顯著增加，但經(jīng)蛭石引發(fā)處理后顯著降低，‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’EC降幅分別為21.66%，13.36%；MDA含量降幅分別為12.34%，25.09%。以上分析表明，蛭石引發(fā)處理番茄種子吸脹期間的細胞膜脂質(zhì)過氧化程度降低，耐鹽性能提高。

圖3 蛭石引發(fā)對鹽脅迫下2種番茄種子吸脹期間MDA含量及EC的影響Fig.3 Effects of solid matrix priming on contents of MDA and EC in two tomato seeds under salt stress

2.4 蛭石引發(fā)對NaCl脅迫下番茄種子吸脹期間可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

由圖4可知，在100 mmol/L鹽脅迫下，與對照相比，‘大紅合作909’未引發(fā)種子可溶性糖含量降低36.10%，‘粉紅合作906’未引發(fā)種子可溶性糖含量升高29.37%。而在無鹽脅迫的情況下，蛭石引發(fā)使‘大紅合作909’可溶性糖含量提高22.50%，‘粉紅合作906’可溶性糖含量降低9.97%?？梢婝}脅迫下2個品種種子吸脹期間可溶性糖含量變化不一致。且蛭石引發(fā)后的種子在鹽脅迫下，可溶性糖含量的變化也不一致，其中‘大紅合作909’可溶性糖含量提高了16.38%，‘粉紅合作906’則降低了31.90%。

在鹽脅迫下，與對照相比，‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’未引發(fā)種子溶性蛋白含量均下降，分別降低10.70%，12.96%，說明鹽脅迫對吸脹期間種子有一定的損傷。但無鹽脅迫情況下，蛭石引發(fā)處理可以提高可溶性蛋白含量，‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’分別提高9.22%，5.14%。比對發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下種子吸脹期間可溶性蛋白含量降低，但蛭石引發(fā)后‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’分別提高了2.63%，5.91%，表明蛭石引發(fā)處理能有效調(diào)節(jié)番茄種子細胞的滲透勢，維持細胞水分平衡，從而提高其耐鹽性。

圖4 蛭石引發(fā)對鹽脅迫下2種番茄種子吸脹期間可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Fig.4 Effects of solid matrix priming on contents of soluble sugar and protein in two tomato seeds under salt stress

2.5 蛭石引發(fā)對NaCl脅迫下番茄種子吸脹期間α-淀粉酶活性的影響

由圖5可知，與對照相比，‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’未引發(fā)種子在鹽脅迫下α-淀粉酶活性分別降低27.13%，37.0%，說明其對100 mmol/L NaCl比較敏感；無鹽脅迫情況下，‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’種子α-淀粉酶活性經(jīng)蛭石引發(fā)后分別提高了18.87%，9.18%。蛭石引發(fā)后鹽脅迫下‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’種子α-淀粉酶活性分別提高了16.63%，16.09%。

α-淀粉酶活性與可溶性糖含量有一定的相關性，而在本研究中，蛭石引發(fā)后種子α-淀粉酶活性和可溶性糖含量均升高。這些糖在種子吸脹期間可供支配利用，以支持碳代謝和生理活動。蛭石引發(fā)能夠增強α-淀粉酶活性，從而促使積累較多的可溶性糖，刺激種子萌發(fā)，提高出苗率，這與SNP和其他引發(fā)作用提高α-淀粉酶活性及可溶性糖含量的結論[20-22]相似。

圖5 蛭石引發(fā)對鹽脅迫下2種番茄種子吸脹期間α-淀粉酶活性的影響Fig.5 Effects of solid matrix priming on activity of α-amylase in two tomato seeds under salt stress

3 討 論

3.1 NaCl脅迫和蛭石引發(fā)對番茄雜交種子活力的影響

鹽對種子發(fā)芽、幼苗生長的影響已在多種作物上有所報道。研究表明，低濃度鹽對種子萌發(fā)和幼苗生長有促進作用，高濃度則有抑制作用[23]。本試驗結果顯示，100 mmol/L NaCl能顯著降低番茄種子的GR、GI、GP，延長MGT，嚴重影響種子活力，這與Zhang[24]的研究結果一致。

完整的膜結構是種子維持活力的基礎。研究表明，在種子萌發(fā)快速吸水過程中，生物膜會受到損傷。引發(fā)能有效控制種子吸水速度，使其有足夠的時間完成生物膜系統(tǒng)、細胞器、DNA修復和酶的活化、生理生化代謝，部分恢復種子干燥前所具有的完善結構與功能，因此具有提高種子活力、增強抗逆性的作用。因此在100 mmol/L NaCl作用下，引發(fā)在一定程度上減輕了番茄種子萌發(fā)期間受到的傷害，為苗期正常生長提供了必要的物質(zhì)基礎。有研究結果也表明，引發(fā)能夠提高多種作物的抗逆性，如提高春玉米[25]、番茄[6]、茄子[26]的耐冷性，莖用萵苣的耐熱性[9]及大米耐旱性[27]等。本研究結果證明，蛭石引發(fā)能有效提高番茄雜交種子在吸脹期間的耐鹽性，為植株后期生長發(fā)育奠定基礎。

3.2 NaCl脅迫和蛭石引發(fā)對番茄雜交種子抗氧化物質(zhì)的影響

種子吸脹是種子萌發(fā)的起始階段，在此過程中種子內(nèi)部會產(chǎn)生大量活性氧(ROS)。ROS與種子活力密切相關，它會引起細胞膜的脂質(zhì)過氧化作用，導致MDA積累、細胞內(nèi)容物質(zhì)外滲，從而對細胞造成損傷。本研究表明，在鹽脅迫下，未引發(fā)番茄種子脂質(zhì)過氧化程度增加，導致吸脹1 d后其EC、MDA含量顯著升高；而用蛭石引發(fā)后兩者顯著降低，種子耐鹽性能顯著提高。Zhang[24]認為，PEG引發(fā)能降低過氧化物和MDA的積累，提高番茄種子的耐鹽性；劉彥文等[9]認為，PEG引發(fā)能降低高溫下莖用萵苣幼苗的MDA含量，表現(xiàn)出較好的耐高溫特性；Azooz[28]則發(fā)現(xiàn)，水楊酸引發(fā)能降低2個耐鹽性不同的大豆品種的MDA含量和電導率，提高其耐鹽性，這與本研究結果相似。

植物的保護酶系統(tǒng)(CAT、SOD、POD、APX)在緩解脅迫方面發(fā)揮著重要作用，它可以清除體內(nèi)的活性氧，以免對植物造成傷害。本研究結果表明，經(jīng)100 mmol/L NaCl鹽溶液脅迫后,2種番茄種子CAT、 SOD、POD、APX活性變化相似，均顯著降低，說明在NaCl處理下，種子是通過抗氧化酶體系的協(xié)同作用清除活性氧的。陳磊等[29]研究表明，抗氧化酶活性在一定范圍內(nèi)隨著鹽濃度的增大而增加，說明低濃度對其有一定的刺激作用，高濃度則降低活性。Azooz[28]發(fā)現(xiàn)，140 mmol/L NaCl可使耐鹽大豆品種的抗氧化酶活性增強，而使鹽敏感型大豆品種的過氧化酶活性降低，Costa等[30]也得到相似的結果，據(jù)此判斷，‘大紅合作909’和‘粉紅合作906’在鹽脅迫下的抗氧化酶體系為鹽敏感型。鹽脅迫降低了種子萌發(fā)期間的抗氧化酶活性，而蛭石引發(fā)后種子抗氧化酶活性顯著升高，對鹽脅迫的適應性增強，這與Azooz[28]和Costa等[30]的研究結果相似。

3.3 NaCl脅迫和蛭石引發(fā)對番茄雜交種子α-淀粉酶活性及可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

本試驗中，鹽處理降低了2個番茄雜交品種種子的α-淀粉酶活性。郭建華等[31]利用不同濃度鹽溶液培養(yǎng)大麥種子，結果顯示，體積分數(shù)1%以上的鹽溶液對α-淀粉酶活性具有明顯的抑制作用。這與本試驗結果一致，但蛭石引發(fā)處理在一定程度上又使α-淀粉酶活性增強，與NO能夠提高低溫脅迫下番茄種子的α-淀粉酶活性[32]結果相似。

可溶性糖是一種重要的滲透調(diào)節(jié)劑，在逆境脅迫條件下，它對細胞膜和原生質(zhì)體有一定的保護作用，還可以在細胞內(nèi)的無機離子濃度偏高時起保護酶類的作用[33]。本研究中，‘大紅合作909’種子在鹽脅迫下可溶性糖含量降低，表明對100 mmol/L NaCl比較敏感，受到一定程度的損傷。這與茄子幼苗可溶性糖含量在高鹽脅迫Ca(NO3)2(30和45 mmol/L)下顯著低于對照的研究結果相似[29]。與此不同的是，‘粉紅合作906’種子在100 mmol/L NaCl脅迫下可溶性糖含量升高;Azooz[34]認為，耐鹽大豆品種在一定高鹽濃度下可溶性糖含量增加，不耐鹽品種則降低。但在蛭石引發(fā)下，‘大紅合作909’可溶性糖含量升高，而‘粉紅合作906’含量降低，后者可能是因為在蛭石引發(fā)條件下，可溶性糖轉(zhuǎn)化蔗糖或者其他多糖，形成新的細胞物質(zhì)，從而促進植物的形態(tài)建成，進而導致種子內(nèi)的可溶性糖含量降低，Khodary[35]、阮松林等[36]研究也有此觀點。2個番茄雜交品種種子內(nèi)可溶性糖含量在鹽脅迫及蛭石引發(fā)下表現(xiàn)不同，可能是因為可溶性糖在種子中用途不同，從而導致其變化不一致。

蛋白質(zhì)作為一種滲透物質(zhì)，對于脅迫下植物的抗逆性有一定的作用，本試驗中鹽導致2種番茄種子可溶性蛋白含量降低，蛭石引發(fā)后又顯著增加，這與Azooz[28]、劉文瑜等[37]的結果相似。此外，蛭石引發(fā)下番茄種子吸脹期間可溶性蛋白質(zhì)含量增加，可增強其滲透調(diào)節(jié)能力，緩解因鹽離子大量進入細胞和植株失水帶來的直接及間接次生傷害。本試驗結果證明，蛭石引發(fā)處理在一定程度上提高了番茄種子吸脹期間滲透物質(zhì)的積累能力，維持細胞繼續(xù)生長，這可能也是引發(fā)處理使種子萌發(fā)期間耐鹽性增強的原因之一。

相比而言，蛭石引發(fā)成本較低，對種子無毒害作用，操作方便、無污染、易執(zhí)行。在100 mmol/L NaCl脅迫下，蛭石引發(fā)后的番茄種子在發(fā)芽特性、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、淀粉酶活性等方面均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，具有較強的耐鹽能力。引發(fā)處理可能對種子萌發(fā)后的基因表達有一定影響，從而提高植物抗鹽脅迫能力，但這種效應可能與一系列酶的協(xié)調(diào)作用有關，關于種子引發(fā)與抗鹽能力間的關系還有待深入研究。