一株氧化木糖無色桿菌對Cd的固定作用

李 哲，吳 迪，張秀芳，趙興敏，周 野，車 馳，李明堂

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，吉林省商品糧基地土壤資源可持續(xù)利用重點實驗室，吉林 長春 130118)

1 材料與方法

1.1 供試菌株和土樣

供試菌株：本課題組分離獲得的1株可通過產(chǎn)生脲酶來分解培養(yǎng)體系中的尿素產(chǎn)生碳酸根離子和銨根離子的菌株LAX2，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，該菌株與氧化木糖無色桿菌(Achromobacterxylosoxidansstrain SR50-12)的遺傳距離最近。菌株LAX2可產(chǎn)活性高達140 U/mL的脲酶，發(fā)酵液pH值可達到9.06。

供試土樣：從吉林省受Cd污染較為嚴(yán)重的地區(qū)采集土樣帶回實驗室，風(fēng)干，過孔徑2 mm篩，用于LAX2菌株對Cd的固定化作用研究。供試土壤的pH為6.67，總Cd和有效態(tài)Cd的含量分別為0.86和0.28 mg/kg。

1.2 主要培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)：蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH=7.0～7.1，121 ℃高壓滅菌25 min, 加入20 g/L的瓊脂粉制備成固體培養(yǎng)基。

含尿素培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蒸餾水定容至900 mL，121 ℃高壓滅菌25 min，待培養(yǎng)基恢復(fù)到室溫時，加入300 g/L的尿素溶液(0.45 μm濾膜)100 mL，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.1。

1.3 LAX2菌懸液的制備與發(fā)酵液及其組分的獲取

菌懸液的制備和培養(yǎng)條件：挑取在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上長勢旺盛的單個LAX2菌落，接種于LB培養(yǎng)基中，于25 ℃、160 r/min 活化24 h后，在4 ℃下以4 000 r/min離心10 min，收集菌體細(xì)胞，接種于LB培養(yǎng)基中，于25 ℃、160 r/min 富集培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)物于4 000 r/min離心10 min，將所獲得的菌體細(xì)胞沉淀用無菌水洗2～3次后，重新懸浮于無菌水，制備成600 nm處吸光值(D600 nm)為0.4左右的菌懸液(每mL約含2×107個菌體細(xì)胞)。

發(fā)酵液的制備及各組分的獲取：將上述制得的菌懸液接種到含尿素的培養(yǎng)基中，于25 ℃、160 r/min下培養(yǎng)24 h，即獲得發(fā)酵液。將發(fā)酵液于8 000 r/min離心5 min，取上清液為無菌發(fā)酵液，將離心沉淀的菌體細(xì)胞重新懸浮于與發(fā)酵液體積相同的無菌水中，即得菌體細(xì)胞。

1.4 菌株LAX2對Cd的耐受性

將活化培養(yǎng)的LAX2菌體細(xì)胞分別接種于Cd2+質(zhì)量濃度為0，5，10，15，20，25，30，35和40 mg/L的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在25 ℃、160 r/min的條件下培養(yǎng)24 h，測定其D600 nm值。

1.5 菌株LAX2對Cd的碳酸鹽礦化作用

1.5.1 礦化產(chǎn)物特征分析 取1.3節(jié)制備的發(fā)酵液200 mL，加入0.1 mol/L的CdCl2溶液10 mL，室溫下放置12 h，過濾后將所得沉淀在50 ℃烘箱中烘干，然后分別進行掃描電鏡、X-射線衍射(XRD)、紅外光譜和能譜分析。用鑷子取一小塊烘干的礦化產(chǎn)物，將其粘附于圓柱形臺子上，表面鍍金后，將樣品放入儀器內(nèi)，放大20 000倍，尋找清晰晶體并拍照，隨后進行能譜元素分析。將礦化產(chǎn)物用瑪瑙研缽研磨，過孔徑為0.048 mm篩后將樣品放入圓形凹槽內(nèi)，壓實，在2θ為3°～80°條件下進行X-射線衍射分析。將礦化產(chǎn)物樣品與KBr按照質(zhì)量比為1∶150混合，放入瑪瑙研缽中研磨，取適量研磨后的樣品放入壓片機進行壓片，然后采用傅里葉紅外光譜儀在波數(shù)為4 000～500 cm-1對樣品進行表面官能團定性分析。

1.5.2 發(fā)酵液不同組分對Cd2+的去除作用 將按1.3節(jié)獲得的發(fā)酵液、無菌發(fā)酵液、菌體細(xì)胞分別用于對Cd2+的去除研究。具體試驗方法如下：向40 mL 質(zhì)量濃度為40 mg/L的CdCl2溶液中分別加入40 mL的發(fā)酵液、無菌發(fā)酵液和菌體細(xì)胞，在室溫下靜置1.5 h后過0.45 μm濾膜，用微波等離子體原子發(fā)射光譜儀測定濾液中Cd2+質(zhì)量濃度，并計算Cd2+的去除率:Cd2+去除率=(去除前Cd2+質(zhì)量濃度-去除后Cd2+質(zhì)量濃度)/去除前Cd2+質(zhì)量濃度×100%。

1.5.3 環(huán)境條件對礦化產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響 分別取1.3節(jié)制備的發(fā)酵液、無菌發(fā)酵液和菌體細(xì)胞5 mL，均勻加入到裝有10 g土的培養(yǎng)皿內(nèi)，并以等體積無菌水作為對照，在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d向培養(yǎng)皿內(nèi)噴灑3 mL無菌水，保持土壤濕潤。將培養(yǎng)10 d后的土壤樣品分別進行正常、淹水、酸化和反復(fù)凍融處理。正常培養(yǎng)處理方式為：將培養(yǎng)過后的土壤放在室溫下，加蒸餾水潤濕，保證其濕度，培養(yǎng)20 d后采集土壤樣品。淹水處理方法為：加入過量的蒸餾水，使其沒過土壤1.5 cm，放于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天補充水分以保證整個試驗過程中淹水狀態(tài)一致，培養(yǎng)20 d后采集土壤樣品。酸化處理方法為：每天向土樣中加入2 mL 濃度為0.02 mol/L的硝酸溶液，酸化至土壤pH為4.52，然后再培養(yǎng)20 d，采集土壤樣品用于測定。反復(fù)凍融方法為：向土樣中加入少量無菌水潤濕，放于4 ℃冰箱2 h后取出，再放于-20 ℃冰箱冷凍12 h，然后取出再次放入4 ℃冰箱中2 h后取出，放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，再進行冷凍、解凍和培養(yǎng)，如此反復(fù)凍融培養(yǎng)20次后采集樣品。所有采集的樣品自然風(fēng)干，過孔徑0.2 mm篩后測定有效態(tài)Cd和總Cd含量，計算有效態(tài)Cd占總Cd的比例。

1.5.4 水稻盆栽試驗 配制CdCl2溶液，均勻加入到供試土壤中，使得土壤中總Cd含量為3.0 mg/kg，在室溫下穩(wěn)定20 d后，用于水稻盆栽試驗。將土壤樣品加入到上口直徑20 cm、下口直徑15 cm、深度20 cm的花盆中，每盆中裝土8 kg，之后分別加入2 L發(fā)酵液、無菌發(fā)酵液和菌體細(xì)胞，以添加2 L無菌水處理作為對照組，每處理重復(fù)3次。每盆施加100 g硝酸鉀復(fù)合肥料后于室外保持淹水狀態(tài)，待土壤緊實后，選取長勢良好且形態(tài)一致的吉梗88水稻秧苗移栽到花盆中，每盆5棵，按照常規(guī)方法進行統(tǒng)一的水分管理，在室外生長120 d后收獲，分別采集水稻根系、莖葉和籽粒，測定其總Cd含量；同時采集植株根部土壤，用于測定有效態(tài)Cd含量[16]。

1.5.5 總Cd和有效態(tài)Cd含量測定 采用王水-高氯酸微波消解法對1.5.3和1.5.4節(jié)樣品進行預(yù)處理，過0.45 μm濾膜后測定Cd含量。采用DPTA浸提劑提取1.5.3和1.5.4節(jié)土壤樣品中有效態(tài)Cd，過0.45 μm濾膜后測定有效態(tài)Cd含量[17]。以上總Cd含量和有效態(tài)Cd含量都利用安捷倫 MP-AES 4100型微波等離子體原子發(fā)射光譜儀進行測定，并通過重復(fù)測定以及使用國家環(huán)保部土壤質(zhì)量控制樣品(QCM-TW001)和大米粉中鎘成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08511)進行全程質(zhì)量控制。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2013進行處理，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用DPS進行差異顯著性分析，用Jade5軟件對礦化產(chǎn)物進行晶形分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株LAX2對Cd2+的耐受性研究

在Cd2+質(zhì)量濃度為0，5，10，15，20，25，30，35，40 mg/L的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中接入菌株LAX2，培養(yǎng)24 h后測定D600 nm，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，當(dāng)Cd2+質(zhì)量濃度為35 mg/L時，菌株LAX2生長速度與0 mg/L時相比顯著下降，此時菌株的長勢良好，但當(dāng)Cd2+質(zhì)量濃度增加至40 mg/L時，菌株的生長受到顯著抑制，生長緩慢且長勢明顯減弱(P<0.05)。

2.2 Cd的碳酸鹽礦化產(chǎn)物特征

菌株LAX2礦化固結(jié)Cd的產(chǎn)物特征如圖2所示。從圖2-A中可以看出，生物礦化產(chǎn)物呈小顆粒團聚結(jié)構(gòu)，形狀相對整齊；圖2-B表明，產(chǎn)物的主要衍射峰出現(xiàn)在23.485°,30.275°,36.415°,43.804°，49.908°和58.237°，與標(biāo)準(zhǔn)PDF卡片(42-1342號卡片)中的012、104、110、202、116、122號波峰的晶面相吻合，其分子式為CdCO3；紅外光譜圖(圖2-C)表明，此產(chǎn)物表面帶有C-O基團；而能譜圖(圖2-D)表明，產(chǎn)物中含有Cd、C和O 3種元素。綜合上述特征，可以推斷菌株LAX2可通過碳酸鹽礦化作用將Cd礦化為呈小顆粒團聚狀體的CdCO3晶體。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著。圖3同Different lowercase letters indicate significant differences.The same for Figure 3圖1 菌株LAX2對Cd2+的耐受性Fig.1 Tolerance of strain LAX2 against Cd2+

A.掃描電鏡圖;B.XRD圖;C.紅外光譜圖;D.能譜圖A.Scanning electron microscopy picture;B.XRD picture;C.Infrared spectrum;D.The energy spectrum圖2 菌株LAX2礦化固結(jié)Cd的產(chǎn)物特征分析 Fig.2 Characteristics of bio-mineralization products of Cd

2.3 發(fā)酵液不同組分對Cd2+的去除作用

發(fā)酵液、無菌發(fā)酵液和菌體細(xì)胞對Cd2+的去除效果如圖3所示。

圖3 菌株LAX2發(fā)酵液不同組分對Cd2+的去除作用Fig.3 Removal of Cd2+ by different components of strain LAX2 fermentation liquid

從圖3可以看出，菌體細(xì)胞吸附作用對Cd2+的去除效果最好，去除率(92.2%)顯著高于無菌發(fā)酵液和發(fā)酵液(P<0.05)；發(fā)酵液生物礦化作用對Cd2+去除效果次之，去除率(89.1%)顯著高于無菌發(fā)酵液(P<0.05)；去除效果最差的為無菌發(fā)酵液，去除率為78.2%。綜上，菌株LAX2的菌體細(xì)胞對Cd具有非常高的吸附能力，從而為生物礦化作用提供了基礎(chǔ)條件，并且證明了這種生物礦化作用兼具細(xì)胞吸附和化學(xué)沉淀兩種過程。

2.4 環(huán)境條件對菌株LAX2礦化固結(jié)有效態(tài)Cd的影響

將經(jīng)過發(fā)酵液、無菌發(fā)酵液和菌體細(xì)胞培養(yǎng)過的稻田土壤分別進行正常培養(yǎng)、淹水、酸化和反復(fù)凍融4種處理后，土壤中有效態(tài)Cd占Cd總量的比例如圖4所示。從圖4可以看出，經(jīng)發(fā)酵液培養(yǎng)過的土壤在正常培養(yǎng)、酸化、淹水或是反復(fù)凍融后，其有效態(tài)Cd含量占Cd總量的比例均無明顯變化(P>0.05)；而經(jīng)無菌發(fā)酵液和菌體細(xì)胞處理的土壤在酸化、淹水、反復(fù)凍融之后，土壤中有效態(tài)Cd占總Cd的比例較正常培養(yǎng)處理分別增加4.3%，6.9%，12.9%和 6.3%，12.3%，17.8%(P<0.05)。以上結(jié)果表明，LAX2發(fā)酵液礦化后的產(chǎn)物在短期內(nèi)對淹水、酸化、反復(fù)凍融都有很強的抗性，生物礦化作用形成的礦化產(chǎn)物性質(zhì)比較穩(wěn)定，對土壤中有效態(tài)Cd的固定具有較強的持久力；而無菌發(fā)酵液和菌體細(xì)胞沉淀后的產(chǎn)物不穩(wěn)定，容易受到環(huán)境的影響導(dǎo)致Cd重新釋放到土壤中。

同一發(fā)酵液組分不同環(huán)境條件處理相比，柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant difference for same fermentation liquid among different conditions (P<0.05)圖4 環(huán)境條件對菌株LAX2礦化固結(jié)有效態(tài)Cd的影響Fig.4 Effects of environmental conditions on bio-mineralization product of Cd by LAX2

2.5 菌珠LAX2對Cd污染稻田土壤的修復(fù)作用

2.5.1 水稻各組織總Cd含量 將采集回來的盆栽水稻的各組織經(jīng)消解處理后測定總Cd含量，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，與對照相比，經(jīng)發(fā)酵液、無菌發(fā)酵液和菌體細(xì)胞處理過的土壤種植的水稻，其根部總Cd含量分別極顯著下降了35.3%，19.4%和12.5%(P<0.01)，莖葉總Cd含量分別極顯著降低了26.7%，15.6%和8.4%(P<0.01)，水稻籽粒中的總Cd含量分別極顯著降低了28.7%，16.4%和7.5%(P<0.01)。以上結(jié)果表明，生物礦化作用對土壤中有效態(tài)Cd的固定效果較好，能夠明顯減少水稻對Cd的吸收和積累，從而降低稻田土壤Cd污染所帶來的人體健康風(fēng)險。

水稻同一部位不同發(fā)酵液組分處理相比，柱上標(biāo)不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05),while capital letters indicate extremely significant difference (P<0.01) for same rice parts among different broth components. The same below.圖5 菌株LAX2發(fā)酵液不同組分對水稻根、莖葉、籽粒中Cd含量的影響Fig.5 Effect of different components of strain LAX2 fermentation liquid on Cd contents in rice root,stem and leaf,and grain

2.5.2 土壤中有效態(tài)Cd含量 菌株LAX2發(fā)酵液不同成分對稻田土壤中有效態(tài)Cd含量的影響如圖6所示。由圖6可知，與對照相比，經(jīng)發(fā)酵液、無菌發(fā)酵液和菌體細(xì)胞修復(fù)后的土壤有效態(tài)Cd含量分別極顯著下降了56.9%，34.5%和21.0%(P<0.01)，表明菌株LAX2發(fā)酵液不同組分對有效態(tài)Cd均有一定的固定化作用，其中以發(fā)酵液的作用最強，表明菌株LAX2在Cd污染稻田土壤修復(fù)方面具有潛在的應(yīng)用價值。

圖6 菌株LAX2發(fā)酵液不同組分對稻田土壤中有效態(tài)Cd含量的影響Fig.6 Effect of different components of strain LAX2 fermentation liquid on the effective Cd content in paddy soil

3 討 論

碳酸鹽礦化菌是一類可以通過自身的生命活動與周圍環(huán)境介質(zhì)之間發(fā)生酶化作用，從而使某些介質(zhì)逐漸礦化形成一種碳酸鹽膠結(jié)物質(zhì)，經(jīng)過漫長的沉積作用最終形成堅硬巖石的微生物[18]。目前一些研究表明，環(huán)境中存在的這類微生物如巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等，可以通過分泌脲酶分解尿素，釋放出碳酸根來礦化固結(jié)環(huán)境中的重金屬[19]。利用微生物的生長和代謝活動固定重金屬的相關(guān)研究表明，微生物活性在固定重金屬過程中起著至關(guān)重要的作用，研究中為了避免因有效態(tài)重金屬濃度過高而致使微生物死亡，一般都選用對重金屬抗性較強的菌株。本研究結(jié)果表明，氧化木糖無色桿菌LAX2對Cd2+的耐受能力較強，其耐受Cd2+的質(zhì)量濃度最高可達到35 mg/L，由于土壤對微生物的毒性作用主要是由土壤中有效態(tài)重金屬產(chǎn)生的，而稻田土壤中有效態(tài)重金屬，尤其是有效態(tài)Cd含量一般不會超過1 mg/kg[20]，因此菌株LAX2在修復(fù)Cd污染稻田土壤方面具有明顯優(yōu)勢。菌株LAX2的發(fā)酵液可將重金屬離子Cd2+礦化生成小顆粒團聚結(jié)構(gòu)的CdCO3，可去除溶液中78.2%的Cd2+。成亮等[12]研究了一株芽孢桿菌對Cd的生物礦化作用，表明該菌的礦化產(chǎn)物也為小顆粒團聚狀的CdCO3，但該菌對Cd2+的耐受質(zhì)量濃度僅為0.595 mg/L。趙越等[21]研究了5株碳酸鹽礦化菌對Cd的去除作用，這5株菌在LB液體培養(yǎng)基中對Cd2+的最高耐受質(zhì)量濃度可達250 mg/L，但該研究并未探討菌株的種類，也沒有對礦化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特征進行分析。菌株LAX2發(fā)酵液的不同組分對Cd2+的去除效果不同，表明生物礦化作用、菌細(xì)胞吸附作用以及化學(xué)沉淀作用之間的機制不同，生物礦化作用首先是菌細(xì)胞吸附重金屬離子形成晶核，然后與代謝產(chǎn)物中的陰離子相結(jié)合，聚集在晶核上，在小分子有機代謝產(chǎn)物的調(diào)控下，逐漸聚合為粒徑大、性質(zhì)穩(wěn)定的團聚結(jié)構(gòu)的礦物[22]，因此生物礦化作用是細(xì)胞吸附和化學(xué)沉淀的疊加。土壤中有效態(tài)重金屬的固定往往受到環(huán)境條件，如pH值、氧化還原條件等的影響[23-24]，一些固定作用和微生物吸附作用等還受到微生物死亡的影響[25-26]。本研究結(jié)果表明，菌株LAX2發(fā)酵液的生物礦化作用生成的產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，在短期內(nèi)對淹水、酸化和反復(fù)凍融都有較強的抗性，即固定的有效態(tài)Cd不會因環(huán)境條件的改變而活化，但生物礦化的長期效應(yīng)仍需要進一步研究。目前關(guān)于Cd的生物礦化實際應(yīng)用研究明顯不足，成亮等[12]研究了芽孢桿菌對小麥土壤Cd的修復(fù)效果，表明該菌株可將土壤中有效態(tài)Cd濃度降低91%以上，進而使小麥Cd含量下降80%以上，因此利用碳酸鹽礦化菌修復(fù)Cd污染土壤是可行的。本試驗研究了菌株LAX2對Cd污染稻田土壤的修復(fù)效果，結(jié)果表明，菌株LAX2可通過生物礦化作用明顯降低水稻根系、莖葉和籽粒中的Cd含量，同時對土壤中有效態(tài)Cd含量也有明顯的降低作用，但關(guān)于菌株LAX2通過碳酸鹽礦化作用固定土壤中Cd的長效性以及如何進一步提高有效態(tài)Cd的固定率還有待于進一步研究。

4 結(jié) 論

1)菌株LAX2對Cd2+的耐受質(zhì)量濃度為35 mg/L，可通過生物成礦作用將Cd2+礦化固結(jié)為呈小顆粒團聚狀的CdCO3晶體。

2)菌株LAX2不同組分對Cd2+去除率的大小順序為菌體細(xì)胞>發(fā)酵液>無菌發(fā)酵液；發(fā)酵液礦化后的產(chǎn)物對短期內(nèi)的土壤淹水、酸化和反復(fù)凍融有較強的抗性，不易活化。

3)修復(fù)試驗結(jié)果表明，菌株LAX2發(fā)酵液的生物礦化作用對Cd的固定效果最好，與對照相比，可使得水稻根部、莖葉和籽粒中Cd含量分別下降35.3%，26.7%和28.7%，土壤有效態(tài)Cd含量下降56.9%。因此菌株LAX2可應(yīng)用于Cd污染稻田土壤的修復(fù)。