中國小麥主產(chǎn)區(qū)品種主要春化基因的組成與分布

李 哲，楊 杰，李瑞博，王曉龍，張曉科，張玲麗

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

小麥?zhǔn)俏覈植甲顬閺V泛的糧食作物之一，在北緯22°～48°、海拔150～4 450 m的不同氣候和耕作條件下均有種植[1-2]。春化特性是小麥適應(yīng)不同氣候條件的重要生理特性，影響小麥種植范圍，也決定適宜播期[3-5]。小麥春化特性主要受春化基因控制，研究春化基因及其等位變異對小麥育種、引種和推廣具有重要指導(dǎo)意義。

研究表明，小麥的春化特性受多個(gè)春化基因位點(diǎn)控制[6-8]，其中VRN-A1、VRN-B1、VRN-D1和VRN-B3是研究比較深入的4個(gè)主要春化基因。VRN-A1位點(diǎn)存在3種顯性等位變異Vrn-A1a、Vrn-A1b和Vrn-A1c，其中Vrn-A1a對春化反應(yīng)的影響最大，可完全消除春化需求[6]。VRN-B1位點(diǎn)至少存在3種顯性等位變異Vrn-B1a、Vrn-B1b和Vrn-B1c。VRN-D1存在3種顯性等位變異Vrn-D1a、Vrn-D1b和Vrn-D1c，顯性等位變異賦予了小麥不同程度春性特點(diǎn)[8-13]。VRN-B3位點(diǎn)已發(fā)現(xiàn)了3種顯性等位變異Vrn-B3a、Vrn-B3b和Vrn-B3c，其中Vrn-B3a和Vrn-B3c促進(jìn)小麥提前抽穗開花，而Vrn-B3b推遲抽穗開花[9]。由此可知，不同位點(diǎn)不同等位變異春化基因?qū)Υ夯枨蟛煌?，決定了小麥冬春特性強(qiáng)弱差異，并通過不同等位變異組合調(diào)控小麥的春化發(fā)育特性[1-6,9-10]。中國幅員遼闊，南北氣溫差異、東西海拔差異很大，要求我國小麥品種對春化作用反應(yīng)表型多樣化，以適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境條件，因此研究不同地區(qū)小麥春化基因組成具有重要意義。本研究利用4個(gè)主要春化基因VRN-A1、VRN-B1、VRN-D1和VRN-B3的相關(guān)分子標(biāo)記，對中國小麥主產(chǎn)區(qū)品種的春化基因組成進(jìn)行檢測，分析其春化基因的等位變異組成特點(diǎn)及其在不同麥區(qū)的分布特征，旨在為我國小麥品種選育和推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為中國小麥主產(chǎn)區(qū)的國審和省審品種，共276份。其中，東北春麥區(qū)9份，北部冬麥區(qū)40份，黃淮冬麥區(qū)113份，長江中下游冬麥區(qū)51份，西北春麥區(qū)21份和西南冬麥區(qū)42份，所選品種基本代表了我國小麥育種和生產(chǎn)現(xiàn)狀。

1.2 基因組DNA的提取

采用CTAB法[14]提取小麥幼苗葉片基因組DNA，每個(gè)品種提取3份DNA作為生物學(xué)重復(fù)，保證結(jié)果的可靠性。

1.3 序列標(biāo)志位點(diǎn)(STS)分子標(biāo)記檢測及春化基因等位變異組成分析

春化位點(diǎn)檢測引物設(shè)計(jì)參考Fu等[10]、Yan等[9]、Milec等[12]、Zhang等[13]和Chen等[11]，并由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中基因組DNA 50 ng，10×buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，Taq酶0.5 U。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50～63 ℃退火30 s，72 ℃延伸42～126 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。引物組合VRN1AF/VRN1-INT1R、Intr1/B/F、Intr1/B/R3和Intr1/B/R4的擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(130 V電壓電泳40～60 min)，其他引物組合的擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(130 V電壓電泳25～30 min)，緩沖體系為1×TAE溶液，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)成像，然后統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并分析各品種春化基因的等位變異類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 春化基因各位點(diǎn)的等位變異組成

2.1.1VRN-A1位點(diǎn) 引物VRN1AF、VRN1-INT1R對VRN-A1位點(diǎn)的檢測結(jié)果見圖1。圖1-A表明，德麥3號等20份材料擴(kuò)增出965和876 bp 2條特異性條帶，推斷其VRN-A1位點(diǎn)為顯性等位變異Vrn-A1a(占7.2%)；甘麥8號等11份材料擴(kuò)增出714 bp特異性條帶，說明VRN-A1位點(diǎn)為顯性等位變異Vrn-A1b(占4.0 %)；其余245份材料均擴(kuò)增出734 bp的特異性條帶，表明VRN-A1位點(diǎn)可能含有隱性vrn-A1或顯性Vrn-A1c等位變異。進(jìn)一步用另外2對引物Intr1/C/F、Intr1/AB/R和Intr1/A/F2、Intr1/A/R3分別對上述245份材料進(jìn)行檢測，結(jié)果(圖1-B)顯示，只擴(kuò)增出1 086 bp特異性條帶，未擴(kuò)增出1 170 bp特異性條帶，說明其VRN-A1位點(diǎn)為隱性等位變異vrn-A1(占88.8%)?？傮w來看，VRN-A1位點(diǎn)隱性等位變異占88.8%；顯性等位變異占11.2%，其中顯性等位變異Vrn-A1a和Vrn-A1b分別占7.2%和4.0%。

2.1.2VRN-B1位點(diǎn) 利用引物Intr1/B/F、Intr1/B/R3和Intr1/B/R4的多重PCR體系，對VRN-B1位點(diǎn)進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖2。圖2表明，鄂麥17等28份材料擴(kuò)增出709 bp特異性條帶，推斷VRN-B1位點(diǎn)為顯性等位變異Vrn-B1a(占10.1%)；鄭麥9023等22份材料擴(kuò)增出673 bp特異性條帶，說明VRN-B1位點(diǎn)為顯性等位變異Vrn-B1b(占8.0%)；其余226份材料擴(kuò)增出1 149 bp特異性條帶，表明VRN-B1位點(diǎn)為隱性等位變異vrn-B1(占81.9%)?？傮w來看，VRN-B1位點(diǎn)隱性等位變異占81.9%；顯性等位變異占18.1%，其中顯性等位變異Vrn-B1a和Vrn-B1b分別占10.1%和8.0%。

A.所用引物為VRN1AF與VRN1-INT1R；B.所用引物為Intr1/C/F與Intr1/AB/R；M.DL2000 Marker；1.德麥3號;2.J411;3.京冬8號；4.煙農(nóng)18；5.遼春10號；6.靖麥7號；7.甘春20號;8.甘麥8號；9.中麥16；10.晉麥67；11.新春2號；12.新春26號A.The primers A are VRN1AF and VRN1-INT1R;B.The primers are Intr1/C/F and Intr1/AB/R;M.DL2000 Marker；1.Demai 3;2.J411;3Jingdong 8；4.Yannong 18；5.Liaochun 10；6.Jingmai 7；7.Ganchun 20;8.Ganmai 8；9.Zhongmai 16；10.Jingmai 67；11.Xinchun 2；12.Xinchun 26圖1 部分參試小麥品種VRN-A1位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification fragments at VRN-A1 locus in several wheat cultivars

M.DL2000 Marker；1.中麥16；2.R57;3.云麥39；4.川育12；5.北麥10；6.隴春20；7.新春6號；8.鄂恩6號；9.石4158；10.鄂麥17；11.鄭麥9023；12.魯麥23M.DL2000 Marker；1.Zhongmai16；2.R57;3.Yunmai 39；4.Chuanyu 12；5.Beimai 10；6.Longchun 20；7.Xinchun 6；8.Een 6；9.Shi 4158；10.Emai 17；11.Zhengmai 9023；12.Lumai 23.圖2 部分參試小麥品種VRN-B1位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification fragments at VRN-B1 locus in several wheat cultivars

2.1.3VRN-D1位點(diǎn) 利用引物Intrl/D/F、Intrl/D/R3和Intr1/D/R4的多重PCR體系，對VRN-D1位點(diǎn)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，川麥47等120個(gè)品種擴(kuò)增出1 671 bp特異性條帶，推斷VRN-D1位點(diǎn)為顯性等位變異；進(jìn)一步利用互補(bǔ)性標(biāo)記(VRN1DF/VRN1-SNP161CR和VRN1DF/VRN1-SNP161A-R)對這120份VRN-D1顯性等位變異類型進(jìn)行檢測，其中111份材料為Vrn-D1a顯性等位變異(40.2%)，9份材料為Vrn-D1b顯性等位變異(占3.3%)。其余156個(gè)品種擴(kuò)增出997 bp特異性條帶，說明這些品種可能含有隱性vrn-D1或顯性Vrn-D1c等位變異，再利用引物VRN1DF/VRN1-SNP161CR對這156份材料進(jìn)一步檢測，結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，襄麥25等3個(gè)品種擴(kuò)增出787 bp特異性條帶，說明這些材料為顯性等位變異Vrn-D1c(占1.1%)，而周麥16等153份材料擴(kuò)增出612 bp特異性條帶，說明這些材料為隱性等位變異vrn-D1(占55.4%)。總體來看，VRN-D1位點(diǎn)隱性等位變異占55.4%；顯性等位變異占44.6%，其中顯性等位變異Vrn-D1a、Vrn-D1b和Vrn-D1c分別占40.2%，3.3%和1.1%。

所用引物為VRN1DF與VRN1-SNP161CR；M.DL2000 Marker；1.豐抗2號；2.淮麥18；3.豫麥57；4.襄麥25；5.皖麥19；6.豫麥50；7.周麥16；8.泰山1號；9.繁105；10.龍輻麥17；11.甘春16號；12.變異4號The primers are VRN1DF and VRN1-SNP161CR；M.DL2000 Marker；1.Fengkang 2；2.Huaimai 18；3.Yumai 57；4.Xiangmai 25；5.Wanmai 19；6.Yumai 50；7.Zhoumai 16；8.Taishan 1；9.Fan 105；10.Longfumai 17；11.Ganchun 16；12.Bianyi 4圖3 部分參試小麥品種VRN-D1位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification fragments at VRN-D1 locus in several wheat cultivars

2.1.4VRN-B3位點(diǎn) 利用引物VRN4-B-INS-F和VRN4-B-INS-R對VRN-B3位點(diǎn)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，僅遼春10號擴(kuò)增出1 200 bp特異性條帶，說明該品種為顯性等位變異Vrn-B3a(占0.4%)；利用引物VRN4-B-NOINS-F和VRN4-B-NOINS-R對其余的275個(gè)品種檢測，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，僅短紅芒麥品種擴(kuò)增出2 030 bp特異性條帶，為顯性等位變異Vrn-B3b(占0.4%)，其余274個(gè)品種擴(kuò)增出1 140 bp特異性條帶，為隱性等位變異vrn-B3(占99.2%)。總體來看，VRN-B3位點(diǎn)隱性等位變異占99.2%；顯性等位變異占0.8%，其中顯性等位變異Vrn-B3a和Vrn-B3b均占0.4%。

所用引物為VRN4-B-NOINS-F 與VRN4-B-NOINS-R；M.DL2000 Marker；1.小偃54；2.短紅芒麥；3.冀麥38；4.荔墾2號；5.西農(nóng)336；6.濟(jì)南17；7.碧螞4號；8.蚰子麥；9.揚(yáng)麥158；10.川麥42；11.墨沙；12.南原1號The primers are VRN4-B-NOINS-F and VRN4-B-NOINS-R；M.DL2000 Marker；1.Xiaoyan 54；2.Duanhongmangmai；3.Jimai 38；4.Liken 2；5.Xinong 336；6.Jinan 17；7.Bima 4；8.Youzimai；9.Yangmai 158；10.Chuanmai 42；11.Mosha；12.Nanyuan 1圖4 部分參試小麥品種VRN-B3位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification fragments at VRN-B3 locus in several wheat cultivars

2.2 春化基因各位點(diǎn)等位變異在不同麥區(qū)的分布特點(diǎn)

在276份品種中，4個(gè)主要春化基因位點(diǎn)之間顯性等位變異的分布頻率不同，由高到低的順序?yàn)閂RN-D1(44.6%)>VRN-B1(18.1%)>VRN-A1(11.2%)>VRN-B3(0.8%)。4個(gè)主要春化基因位點(diǎn)顯性等位變異在不同麥區(qū)的分布頻率見表1。

表1 4個(gè)主要春化基因位點(diǎn)顯性等位變異在不同麥區(qū)的分布頻率Table 1 Distribution of allele at four loci of vernalization genes in different wheat regions

注：Ⅰ.北部冬麥區(qū)；Ⅱ.黃淮冬麥區(qū)；Ⅲ.長江中下游冬麥區(qū)；Ⅳ.西南冬麥區(qū)；Ⅴ.東北春麥區(qū)；Ⅵ.西北春麥區(qū)。下同。
Note:Ⅰ.Northern winter wheat region；Ⅱ.Huanghuai winter wheat region；Ⅲ.Yangzi River winter wheat region；Ⅳ.Southwestern winter wheat region；Ⅴ.Northeastern spring wheat region；Ⅵ.Northwestern spring wheat region.The same below.

由圖1可知，春化基因在各麥區(qū)中的分布頻率有很大差異，其中顯性等位變異Vrn-A1分布頻率從高到低依次為東北春麥區(qū)(100.0%)>西北春麥區(qū)(76.2%) >西南冬麥區(qū)(7.1%)>長江中下游冬麥區(qū)(5.9%)>北部冬麥區(qū)(0.0%)=黃淮冬麥區(qū)(0.0%)；顯性等位變異VRN-B1分布頻率依次為東北春麥區(qū)(88.9%)>西北春麥區(qū)(66.7%)>西南冬麥區(qū)(35.7%)>黃淮冬麥區(qū)(8.8%) >長江中下游冬麥區(qū)(5.9%)>北部冬麥區(qū)(0.0%)；顯性等位變異VRN-D1分布頻率依次為長江中下游冬麥區(qū)(92.2%)>西南冬麥區(qū)(88.1%)>東北春麥區(qū)(66.7%)>西北春麥區(qū)(33.3%)>黃淮冬麥區(qū)(23.0%)>北部冬麥區(qū)(0%)；276份小麥品種中VRN-B3主要以隱性等位變異類型vrn-B3組成(99.2%)，其顯性等位變異類型分布很少。

2.3 春化基因等位變異的組合及其分布特點(diǎn)

在276份小麥品種中，4個(gè)春化基因位點(diǎn)共存在9種等位變異組合類型(表2)，不同等位變異組合類型的總體分布比例不同，以vrn-A1/vrn-B1/VRN-D1/vrn-B3組合類型比例最高(33.7%)。不同等位變異組合類型在各麥區(qū)中的分布頻率也有很大差異，其中北部冬麥區(qū)品種的春化基因全部為隱性等位變異組合類型；在黃淮冬麥區(qū)、長江中下游冬麥區(qū)和西南冬麥區(qū)中，VRN-D1位點(diǎn)為顯性等位變異的組合類型在品種內(nèi)占主導(dǎo)地位；在東北春麥區(qū)和西北春麥區(qū)，品種的春化基因組合主要以VRN-A1和VRN-B1位點(diǎn)同時(shí)為顯性等位變異的組合形式存在。

表2 4個(gè)主要春化基因位點(diǎn)不同等位變異組合的分布頻率Table 2 Distribution of allelic combination at four loci of vernalization genes %

3 討 論

依據(jù)自然條件、耕作特點(diǎn)及小麥的生態(tài)型等，我國小麥種植區(qū)域被劃分為10個(gè)麥區(qū)[15]。不同麥區(qū)小麥品種的春化基因組成差異反映了不同環(huán)境對品種春化特性的要求，是小麥環(huán)境適應(yīng)性的分子基礎(chǔ)。小麥的春化特性受多基因調(diào)控的復(fù)雜生理過程決定[3-5]，其中顯性春化基因VRN-A1、VRN-B1、VRN-D1對低溫春化的要求不同，攜帶VRN-A1的小麥品種不需要春化就能抽穗開花，攜帶VRN-D1的小麥品種需要一定春化作用，VRN-B1介于兩者之間[16]。本研究結(jié)果表明，我國小麥品種春化基因顯性等位變異中VRN-D1所占比例(44.6%)最高，并在6大麥區(qū)均有分布，表明在中國小麥品種中控制春化特性的主要是對春化作用需求較強(qiáng)的VRN-D1；而不需要春化作用的顯性等位變異VRN-A1主要分布在東北春麥區(qū)和西北春麥區(qū)；需求較弱的VRN-B1，除北部冬麥區(qū)外均有分布，分布比例由低緯度向高緯度遞增。與姜瑩等[17]研究結(jié)果不同的是，本研究長江中下游冬麥區(qū)品種出現(xiàn)了VRN-A1和VRN-B1位點(diǎn)的顯性等位變異，比例均為5.9%；黃淮冬麥區(qū)品種出現(xiàn)了VRN-B1位點(diǎn)顯性等位變異品種，分布頻率為8.8%，說明近年來隨著氣候變暖，顯性春化基因VRN-A1和VRN-B1可能通過后期育種已導(dǎo)入到了這些地區(qū)的小麥品種內(nèi)。

冬小麥?zhǔn)俏覈钪饕男←滎愋汀τ谀昶骄湍陿O端溫度低、冬季最冷月(1月)平均氣溫低和無霜期較短的地區(qū)，秋播小麥無法安全越冬，需要種植春小麥。與冬小麥相比，春小麥生育期短，苗期溫度較高或低溫時(shí)間較短，因此春麥區(qū)需要種植春性較強(qiáng)的品種。從6個(gè)麥區(qū)小麥生產(chǎn)實(shí)踐來看[18]，東北春麥區(qū)(生育期75～95 d)和西北春麥區(qū)(生育期100～130 d)等春麥區(qū)小麥生育期較短，并隨緯度增高而變短；長江中下游冬麥區(qū)(生育期181～218 d)、西南冬麥區(qū)(生育期180～220 d)、黃淮冬麥區(qū)(生育期225～260 d)、北部冬麥區(qū)(生育期270～280 d)等冬麥區(qū)小麥生育期相對較長，并隨緯度增高而延長。小麥為了適應(yīng)地區(qū)氣候等條件要求，春化基因組成表現(xiàn)出相應(yīng)特點(diǎn)。在東北春麥區(qū)和西北春麥區(qū)，品種多以對春化作用不敏感的VRN-A1和VRN-B1位點(diǎn)的顯性等位變異組合為主，比例大體隨著緯度的增大而增加，品種春性特性增強(qiáng)，與生育期縮短相吻合。在黃淮冬麥區(qū)、西南冬麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū)，品種春化基因組成類型以對春化需求較弱的VRN-D1位點(diǎn)顯性等位變異占主導(dǎo)地位，并隨緯度增高而遞減，品種冬性逐漸增加，抗冬性增強(qiáng)，生育期延長。

因分子標(biāo)記限制，本研究只完成了我國主產(chǎn)麥區(qū)小麥品種春化基因VRN-A1、VRN-B1、VRN-D1、VRN-B3位點(diǎn)組成分析，隨著其他春化基因如VRN2和VRN4位點(diǎn)研究的深入，對這些位點(diǎn)基因組成進(jìn)行分析，將可全面解釋我國小麥對春化反應(yīng)的分子組成特點(diǎn)，更好地為小麥育種和推廣提供理論依據(jù)。