大豆NUDX基因家族全基因組分析

常 瑋，王 娟，于 洋，陳吉寶

(南陽師范學(xué)院 農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽473061)

大豆(Glycinemax)是自交作物，在自然條件下天然異交率較低(約為0.5%)[1]。與玉米等作物相比，大豆群體的遺傳多樣性較為單調(diào)，加之大豆為光周期敏感植物，也極大地限制了不同地域、不同類型大豆之間的基因交流[2-3]。因此，多年來以雜交為主要手段的大豆育種，在優(yōu)異大豆種質(zhì)創(chuàng)制方面進(jìn)展緩慢。

目前在作物育種上主要依靠人工誘變創(chuàng)建突變體庫來獲得新變異[4]。近幾年，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯[5]，以及遠(yuǎn)緣嫁接等方法進(jìn)行突變體誘導(dǎo)[6]，不僅使突變更具方向性，而且還增加了優(yōu)異變異的幾率。但在突變產(chǎn)生的同時及遺傳過程中，生物體內(nèi)會產(chǎn)生一系列有效的保護(hù)機(jī)制來修復(fù)這些變異，稱之為DNA修復(fù)系統(tǒng)(DNA repair system)。目前已知的修復(fù)機(jī)制包括：錯配修復(fù)(Mismatch repair)、AP修復(fù)(AP repair)、核苷酸切除修復(fù)(Nucleotide excision repair)、光復(fù)活(Photoreactivation)、DNA損傷旁路(DNA damage bypass)、SOS修復(fù)(SOS repair)以及模板指導(dǎo)的缺口修復(fù)(Template-directed gap repair)[7-11]。除此之外，在生物體內(nèi)還存在著一種與突變的發(fā)生和抑制相關(guān)的基因，稱為增變基因(Mutators)。MutT同源酶1(MutT homolog 1, MTH1)基因是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一類增變基因。MTH1屬于Nudix(Nucleoside diphosphate linked to x)水解酶超級家族(NUDX)，是一類具有不同程度底物特異性的水解酶，可以水解包括核苷二磷酸、核苷三磷酸及RNA帽等一系列有機(jī)焦磷酸鹽。該酶可將細(xì)胞核苷酸池中的氧化嘌呤核苷酸，如8-氧化鳥嘌呤核苷酸(8-oxo-GTP)、2-羥基腺嘌呤脫氧核苷酸(2-OH-dATP)等水解為核苷單磷酸酯和無機(jī)焦磷酸鹽，阻止氧化嘌呤核苷酸錯誤地編入DNA或RNA中，從而大大減少核酸損傷和突變，在維護(hù)遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性以及核酸損傷修復(fù)機(jī)制中起著重要作用[12]。

目前，有關(guān)NUDX在DNA修復(fù)中作用機(jī)制的研究主要集中于原核生物和哺乳動物[13-14]，而關(guān)于其在植物基因組DNA修復(fù)中的作用研究較少。?，|等[15]采用改進(jìn)的超級集群分離分析法(Super bulked segregant analysis,Super-BSA)，利用大豆HapMap數(shù)據(jù)(包含19 652份材料，52 041個位點(diǎn))對與大豆基因組點(diǎn)突變比率相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)進(jìn)行定位，結(jié)果表明，Gm16上的29 153 474-30 604 603 bp、Gm17上的12 133 293-12 147 725 bp均與目標(biāo)性狀存在極強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，上述2區(qū)間內(nèi)均存在一個Nudix水解酶同系物(Glyma16g26440.1和Glyma17g15420.1)，這間接表明了大豆NUDX基因與基因組突變的關(guān)系。

近年來隨著越來越多植物基因組序列測序工作的完成，植物NUDX基因的鑒定工作也取得了較多進(jìn)展。研究人員通過同源比對的方式已經(jīng)分別從擬南芥基因組(～130 Mb)、水稻基因組(～430 Mb)、毛果楊基因組(～480 Mb)及葡萄基因組(～500 Mb)獲得了32，33，53和30個推定的NUDX基因[16]。本研究擬采用全基因組掃描方式，通過對擬南芥、水稻等植物NUDX水解酶蛋白一級結(jié)構(gòu)的分析，獲取序列特征，再根據(jù)該特征在大豆全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行NUDX基因的挖掘，最后通過系統(tǒng)進(jìn)化分析、表達(dá)分析來獲得大豆NUDX基因家族的進(jìn)化情況及表達(dá)特征。

1 材料與方法

1.1 大豆NUDX(GmNUDX)基因的全基因組掃描

以擬南芥NUDXs蛋白一級結(jié)構(gòu)作為參考，通過DNAMAN (v8.0.8.789)的同源比對功能識別NUDXs蛋白一級結(jié)構(gòu)，分析保守結(jié)構(gòu)域；統(tǒng)計保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)每個位點(diǎn)氨基酸類型的特征；在此基礎(chǔ)上根據(jù)Perl語言正則表達(dá)式進(jìn)行編碼，并利用Perl語言模式匹配函數(shù)對大豆基因組Wm82.a2.v1[17](http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)進(jìn)行掃描。獲取候選基因后，采用TargetP1[18](http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和WoLF-PSORT[19](http://wolfpsort.org/)對各候選基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果進(jìn)行預(yù)測。

1.2 大豆NUDX基因的多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析

在全基因掃描的基礎(chǔ)上，采用Clustal X對獲得的大豆NUDX基因進(jìn)行多序列比對，將比對結(jié)果導(dǎo)入MEGA5.1進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析[20]。采用鄰接法(Neighbour-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)抽樣1 000次分析系統(tǒng)樹各分支的置信度。

1.3 大豆NUDX基因的表達(dá)模式分析

為了闡明大豆NUDX基因的表達(dá)模式，以通過高通量測序技術(shù)獲得的來自大豆10個不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(登錄號SRX062325-SRX062334，下載地址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)為基礎(chǔ)，通過分析候選基因在不同組織中的表達(dá)豐度來比較不同基因的表達(dá)差異。候選基因表達(dá)豐度的比較參考Eisen等[21]的方法：數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化處理后，首先減去歸一化后的均值，使數(shù)據(jù)集中心化；然后將中心化后的數(shù)據(jù)除以標(biāo)準(zhǔn)差，并以此來比較不同候選基因的表達(dá)差異。最終根據(jù)計算結(jié)果，采用R程序包gplots中的heatmap.2函數(shù)(http://CRAN.R-project.org/package=gplots)繪制熱量圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmNUDXs全基因組掃描

根據(jù)統(tǒng)計，NUDXs蛋白一級結(jié)構(gòu)保守結(jié)構(gòu)域為GX5EX7REUXEEXGU，其中X為任意氨基酸，U為Ile、Leu、Val，其Perl語言正則表達(dá)式為“Gw{5}Ew{7}RE[ILV]wEEwG[ILV]”。如表1所示，通過全基因組掃描，在20條大豆染色體中共鑒定出69個NUDX基因(GmNUDX1-GmNUDX69)，其中56個具有單Nudix 水解酶結(jié)構(gòu)域(Nudix hydrolase domain，NHD)；另外13個GmNUDXs除具有NHD外，還有其他的結(jié)構(gòu)，例如GmNUDX9和GmNUDX40分別具有2個NHD；GmNUDX5、GmNUDX21及GmNUDX53分別在其C末端包含一個 NADH焦磷酸酶鋅帶結(jié)構(gòu)域(zr-NADH-PPase)；GmNUDX46的C末端具有1個肽酶基序(Peptidase motif，PM)；GmNUDX39、45、52、62等4個基因各包含1個mRNA脫帽結(jié)構(gòu)(Dcp2)膜結(jié)合基序。

69個NUDX基因的亞細(xì)胞定位結(jié)果(表1)表明，其中有12個基因具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽結(jié)構(gòu)，定位于葉綠體上；18個基因具有線粒體靶向肽，定位于線粒體上；8個基因具有核定位信號；6個基因具有信號肽；4個基因定位于質(zhì)膜上;剩余的21個基因定位于胞漿內(nèi)；沒有定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體上的GmNUDX基因。

表1 GmNUDX基因家族匯總信息Table 1 Information of GmNUDX gene family

表1(續(xù)) Continued table 1

注：NHD、zr-NADH-PPase、DNHD、Tr、PM和Dcp2分別表示nudix水解酶結(jié)構(gòu)域、NADH焦磷酸酶鋅帶結(jié)構(gòu)域、雙nudix水解酶結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、肽酶基序及mRNA脫帽結(jié)構(gòu)。
Note:NHD,zr-NADH-PPase,DNHD,Tr,PM and Dcp2 are the abbreviations of nudix hydrolase domain,NADH pyrophosphatase zinc ribbon,double nudix hydrolase domain,transmembrane region, and decapping mRNA 2,respectively.

2.2 GmNUDXs染色體的分布及系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了闡明大豆NUDX基因家族在基因組上的分布規(guī)律，以大豆基因組(Wm82.a2.v1)為參考，利用BLAST比對軟件中的blastn函數(shù)對69個GmNUDXs進(jìn)行了染色體定位，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，69個GmNUDXs分散于全部20條大豆染色體上，但每條染色體上分布的GmNUDXs數(shù)目有一定差異，其中2號、9號染色體上的基因數(shù)目最多，均為7個；而3號、6號、12號、19號染色體上的基因最少，均只有1個。此外，定位結(jié)果還表明，大多數(shù)的GmNUDXs分布于各條染色體的兩端，只有GmNUDX12、13、14、15和23分布于距離著絲粒較近的區(qū)域，這一結(jié)果表明大豆染色體發(fā)生加倍時,同源染色體之間發(fā)生了重排。

圖1 GmNUDXs在大豆20條染色體上的分布圖Fig.1 Genomic distribution of GmNUDXs on soybean chromosomes

為了揭示不同GmNUDXs之間的進(jìn)化關(guān)系，依據(jù)69個GmNUDXs的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。由圖2可以看出，與大豆中其他基因家族相似，大多數(shù)GmNUDXs具有2個拷貝，這也反映出了大豆古老的基因組復(fù)制事件。在全部69個GmNUDXs中，共有54個(27對)基因在系統(tǒng)進(jìn)化樹上成對出現(xiàn)。結(jié)合之前的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果進(jìn)一步分析可知，親緣關(guān)系較近的基因通常在進(jìn)化樹上位于相同的分支上，例如：4個定位于線粒體上的GmNUDXs(GmNUDX10、35、48、51)，在進(jìn)化樹聚為一支；4個具有信號肽結(jié)構(gòu)的基因(GmNUDX28、39、42、62)在進(jìn)化樹上聚為一支。

圖2 GmNUDX基因家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig.2 Phylogenetic relationship of soybean NUDX family

2.3 GmNUDX基因家族的表達(dá)模式分析

根據(jù)NCBI公布的大豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對上述挖掘到的GmNUDX基因家族的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，大部分GmNUDX基因家族基因的表達(dá)沒有表現(xiàn)出組織差異性，但表現(xiàn)出了顯著的豐度差異：在全部69個GmNUDXs中，24個基因具有較高的表達(dá)豐度；26個基因具有中等表達(dá)豐度；10個基因具有較低表達(dá)豐度。9個GmNUDXs基因(GmNUDX14，39，40，41，59，61，63，64，65)沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)序列，表明其可能為假基因。

3 討 論

3.1 GmNUDXs結(jié)構(gòu)及功能分析

在本研究所獲得的69個GmNUDXs中，56個具有單NHD結(jié)構(gòu)單元，另外13個GmNUDXs還具有其他的結(jié)構(gòu)單元，其中3個(GmNUDX5，21，53)具有zr-NADH-PPase結(jié)構(gòu)域。對擬南芥AtNUDX2的研究表明，zr-NADH-PPase結(jié)構(gòu)域具有以ADP核糖和NADH為底物的焦磷酸酶活性[12,16]，AtNUDX2過表達(dá)的擬南芥植株會表現(xiàn)出對氧化應(yīng)激的耐受性增強(qiáng)[22]，由此推測GmNUDXs(GmNUDX5，21，53)可能在大豆中發(fā)揮相似功能。GmNUDX46含有1個PM結(jié)構(gòu)域，與AtNUDX3同源，盡管該基因的具體功能還未知，但對擬南芥的表達(dá)分析顯示，AtNUDX3可被干旱、鹽漬、冷熱脅迫等極端條件誘導(dǎo)表達(dá)，表明GmNUDX46基因可能參與多種生理功能[23-24]。GmNUDX39、45、52、62等4個基因各包含一個Dcp2膜結(jié)合基序。Dcp2能夠水解mRNA的帽子結(jié)構(gòu)，這對于真核細(xì)胞mRNA的降解至關(guān)重要，而mRNA降解在細(xì)胞增殖與分化、脅迫響應(yīng)，以及轉(zhuǎn)錄本質(zhì)量控制等方面都具有重要意義，這再次表明GmNUDXs在大豆各項生理活動中具有重要作用[25]。

圖3 GmNUDX基因家族在不同組織中的表達(dá)量熱量圖Fig.3 The heat map of GmNUDX family in different tissues.

與大豆中的許多其他基因相似，GmNUDXs表現(xiàn)出了易于成對出現(xiàn)的基因組分布模式，再次反映出了古老的基因組大規(guī)模復(fù)制事件[26-27]。這一復(fù)制事件使得每個基因的2個拷貝在經(jīng)歷重排后增加了基因的多樣性。如此多的成員數(shù)目及結(jié)構(gòu)域類型，使得GmNUDXs在大豆的生長發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)過程中具有重要作用。

3.2 GmNUDXs的進(jìn)化特征

通過對比GmNUDXs在染色體上的位置及其進(jìn)化關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)：如果幾個GmNUDXs成簇出現(xiàn)在某染色體上，則它們的同源序列也會按照相應(yīng)的順序出現(xiàn)在另外的染色體上。例如：GmNUDX3和GmNUDX37位于4號染色體上的同一基因簇內(nèi)，它們的同源序列GmNUDX27和GmNUDX68以相同的順序出現(xiàn)在9號染色體上，13號染色體上的GmNUDX47和GmNUDX40以及15號染色體上的GmNUDX64和GmNUDX9也表現(xiàn)出相同的模式。這一現(xiàn)象為包含GmNUDXs的大豆染色體區(qū)段重復(fù)提供了有力證據(jù)。同樣的染色體重復(fù)現(xiàn)象已經(jīng)被證實在大豆許多基因家族的進(jìn)化過程中發(fā)揮著重要作用[28-29]。

3.3 GmNUDXs的表達(dá)模式

在本研究中，有9個GmNUDX基因(GmNUDX14，39，40，41，59，61，63，64，65)在大豆的全部10個組織中均未發(fā)現(xiàn)表達(dá)序列。這一結(jié)果表明，這些基因可能為假基因或只在特定的環(huán)境條件或發(fā)育階段才表達(dá)。植物中存在許多假基因，包括非加工和加工假基因2種類型[30]。非加工假基因通常指在復(fù)制過程中發(fā)生功能缺失突變的基因序列，多位于其同源功能基因側(cè)翼。在本研究涉及的9個未發(fā)現(xiàn)表達(dá)序列的基因中，GmNUDX39，40，63，64，65均有1個與之同源且具有表達(dá)量的功能基因，分別為GmNUDX28，7，30，47和11，這一結(jié)果暗示這5個基因成為假基因的可能；GmNUDX7和GmNUDX11分別位于GmNUDX40和GmNUDX65的側(cè)翼，表明其可能為非加工假基因。除此之外，其余60個GmNUDXs基因在大豆的全部10個組織中均有表達(dá)，沒有表現(xiàn)出組織差異，只表現(xiàn)出了表達(dá)量的差異，表明其在大豆中可能具有多種功能。

4 結(jié) 論

從大豆基因組數(shù)據(jù)庫中挖掘到69個GmNUDXs，分布于大豆的20條染色體，其中60個在10個組織中均有表達(dá)，沒有表現(xiàn)出組織差異，只表現(xiàn)出了表達(dá)量的差異。大豆NUDX基因家族基因的多態(tài)性及表達(dá)量差異表明，其在大豆的多項生理活動中具有重要作用。