灰樹花胞外粗多糖脫色工藝優(yōu)化及對α-葡萄糖苷酶抑制作用的影響

劉力萍，吳天祥，2*，張宗啟

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 明德學院，貴州 貴陽 550025）

灰樹花（Grifola frondosa）是一種藥食兼用的珍稀菌類，又名貝葉多孔菌[1]?；覙浠ǘ嗵亲鳛槠渲饕钚猿煞种唬哂锌鼓[瘤[2]、降血糖[3-4]、抗氧化[5-6]、免疫調節(jié)[7]等藥理作用。

傳統工藝提取的灰樹花胞外多糖雜質多、顏色深，影響其進一步的分離純化與結構鑒定，也不利于多糖作為功能性產品的研究與開發(fā)，因此對其進行脫色處理是極其必要的。多糖的脫色方法有過氧化氫法[8]、活性炭法[9]、樹脂法[10]等。其中，過氧化氫法脫色是利用過氧化氫在水溶液中電離出過氧化氫根離子（HO2-）與發(fā)色基團作用，使得發(fā)色基團被破壞而起到脫色作用，但過氧化氫是強氧化劑，易使多糖結構發(fā)生改變，并影響多糖活性?；钚蕴糠撋强糠兜氯A力將色素吸附到自身表面，從而達到脫色目的，其在水和空氣的凈化中已得到廣泛應用[11]。但用其脫色后殘留的活性炭難以清除，對多糖品質有一定影響[12]。樹脂是一種具有吸附性能的脫色劑，其理化性質穩(wěn)定，反應條件溫和，對色素具有較強的吸附力，但對糖類物質的吸附力較弱，因此被廣泛應用于食藥用真菌多糖的脫色提純中，如香菇多糖、西洋參粗多糖等利用樹脂進行脫色后均具有較為理想的脫色效果[13-14]。

α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類通過競爭性抑制小腸粘膜刷狀緣上的α-葡萄糖苷酶活性而起到降低餐后高血糖作用的口服藥物[15-16]。相關研究表明灰樹花多糖可作為一種天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑，具有降血糖的作用[17]。

因此，本研究以多糖脫色率和保留率為評價指標，從8種大孔樹脂中篩選出對灰樹花胞外粗多糖脫色最佳的樹脂，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化得到其最佳脫色條件，并探究脫色對多糖的α-葡萄糖苷酶抑制作用的影響，以期為灰樹花胞外多糖的開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

灰樹花（Grifola frondosa）5.404：中國普通微生物菌種保藏管理中心（China general microbiological culture collection center，CGMCC）。

1.1.2 試劑

D315樹脂、D914樹脂、D208樹脂、D303樹脂、聚酰胺樹脂：鄭州勤實科技有限公司；AB-8樹脂、D101樹脂、D201樹脂：天津光復精細化工研究所；α-葡萄糖苷酶（≥10 U/mg）、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）（純度為99%）：美國Sigma公司；阿卡波糖：拜耳醫(yī)藥保健有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸氫二鉀3g/L、硫酸鎂1.5g/L、水1000mL，pH自然。121℃滅菌30 min。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、玉米粉10 g/L、麩皮10 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、CaCl21 g/L。121 ℃滅菌30 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、玉米粉5 g/L、麩皮10 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、CaCl21 g/L。121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

ZWY-C2112B型雙層旋轉式可編程恒溫恒濕搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；L5S紫外可見光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；SPECTRA MAX 190酶標儀：昆明納瑞科技有限公司；CTFD-12S冷凍干燥機：青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 灰樹花胞外粗多糖的制備

斜面種子培養(yǎng)：從母種試管中切取黃豆粒大小的灰樹花菌絲體于PDA斜面中部，25℃恒溫培養(yǎng)，至菌絲長滿整個斜面，轉至4℃保存。

液體種子培養(yǎng)：在斜面菌種管中用接種勺取一勺細小菌絲體，接種于液體種子培養(yǎng)基中，裝液量為100mL/250mL，于25℃、150 r/min搖床內培養(yǎng)6 d。

液體發(fā)酵培養(yǎng)：按10%（V/V）的接種量將液體種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，于25℃、150 r/min搖床培養(yǎng)9 d。

灰樹花胞外粗多糖的制備：灰樹花發(fā)酵液經過濾得到上清液，旋轉蒸發(fā)至總體積的1/5，加入4倍體積體積分數為95%的乙醇溶液，于4℃條件下靜置24 h，4 000 r/min離心20 min，收集沉淀，55℃烘干至質量恒定，采用蒸餾水溶解于培養(yǎng)皿中，真空冷凍干燥，得到灰樹花胞外粗多糖[18]。

1.3.2 樹脂的篩選

樹脂預處理：離子交換樹脂（D315樹脂、D914樹脂、D208樹脂、D303樹脂、聚酰胺樹脂）用體積分數為95%的乙醇溶液浸泡12 h，先用蒸餾水洗至流出液用水稀釋不渾濁，再用質量分數為4%的NaOH溶液攪拌浸泡4 h（每10 min攪拌一次），使用蒸餾水反復洗至中性，最后再用質量分數為4%的HCl溶液攪拌浸泡4 h（每10 min攪拌一次），使用蒸餾水反復洗至中性。吸附樹脂（AB-8樹脂、D101樹脂、D201樹脂）用體積分數為95%的乙醇溶液浸泡12 h，使其充分溶脹，用蒸餾水反復洗至流出液用水稀釋不渾濁、無醇味。

樹脂的篩選：準確量取5.00 g經預處理的8種樹脂于100 mL三角瓶中，分別加入用蒸餾水配制的灰樹花胞外粗多糖溶液（10 mg/mL）20 mL，將溶液pH調節(jié)為6.0，于25℃、150 r/min搖床振蕩24 h，過濾得到上清液，并于波長450 nm處測定其吸光度值并計算多糖脫色率。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[19]，計算多糖保留率。篩選出最優(yōu)樹脂。多糖脫色率及保留率計算公式如下：

1.3.3 脫色工藝優(yōu)化單因素試驗

準確稱取5.00 g經預處理的最優(yōu)大孔樹脂于100 mL三角瓶中，加入用蒸餾水配制的灰樹花胞外粗多糖溶液20mL，采用單因素輪換法，選擇樹脂脫色時間、粗多糖質量濃度（2 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL）、脫色溫度（15℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃）及脫色pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），于150 r/min、25 ℃的搖床中振蕩脫色，雙層濾紙過濾得到上清液，計算其脫色率及保留率，考察4個因素對樹脂脫色的影響。

1.3.4 脫色工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以灰樹花粗多糖脫色率（Y1）和保留率（Y2）為評價指標，選取脫色時間（A）、脫色溫度（B）、脫色pH值（C）、粗多糖質量濃度（D）4個因素進行4因素3水平的正交試驗。正交試驗因素與水平見表1。

表1 灰樹花胞外粗多糖脫色工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for decolorization process optimization of extracellular crude polysaccharides fromGrifola frondosa

1.3.5 灰樹花胞外粗多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制[20-21]

灰樹花胞外粗多糖溶液的配制：用pH6.8的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersaline，PBS）將脫色前后的灰樹花胞外粗多糖配成質量濃度分別為10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL的溶液。

α-葡萄糖苷酶活性抑制活性測定：取200μL粗多糖溶液，加入PBS200μL，1U/mL的α-葡萄糖苷酶液10μL，混勻，37℃恒溫30 min，然后取出加入底物PNPG（10 mmol/L）200 μL，37℃恒溫60 min，取出加入1 mol/L的反應終止液NaCO3溶液200 μL。在波長405 nm處測定其吸光度值。以10 mg/mL的阿卡波糖為陽性對照，測定脫色前后不同質量濃度灰樹花胞外粗多糖對α-葡萄糖苷酶抑制率，其計算公式如下：

式中：ODA為粗多糖溶液反應體系的吸光度值；ODB為PBS替代酶液反應體系的吸光度值；ODC為PBS替代粗多糖溶液反應體系的吸光度值；ODD為PBS替代酶液和粗多糖溶液反應體系的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 樹脂的篩選

8種樹脂對灰樹花胞外粗多糖的脫色效果見表2。由表2可知，其中D201、D315、D101、D941樹脂的脫色率均在80%以上，但D201樹脂為強堿性陰離子交換樹脂，對灰樹花胞外粗多糖的吸附大，使得多糖保留率低，為42.13%。聚酰胺樹脂的多糖保留率最高，為77.36%，但其脫色率較低，為47.29%，不適合用于灰樹花胞外多糖脫色。而D315樹脂在多糖脫色率和保留率兩方面均較高，分別為87.83%和74.11%。因此，選擇D315樹脂進行單因素試驗和正交試驗。

表2 8種樹脂的脫色能力比較Table 2 Comparison of decolorization capability of eight types of resin

2.2 灰樹花胞外粗多糖脫色單因素試驗

2.2.1 D315樹脂的靜態(tài)吸附色素動力學過程

D315樹脂的靜態(tài)吸附色素動力學曲線如圖1所示。由圖1可知，隨著脫色時間的延長，D315樹脂的脫色效果明顯增強，脫色時間在300 min時，脫色率為83.13%，之后脫色率增加趨勢緩慢，分析原因可能是色素的吸附與解析幾乎達到平衡，脫色時間在360 min之后，脫色率基本穩(wěn)定，為85.29%。因此，灰樹花胞外粗多糖的最佳脫色時間為360 min。

圖1 D315樹脂的靜態(tài)吸附色素動力學曲線Fig.1 Kinetic curve of static adsorption of D315 resin on pigments

2.2.2 粗多糖質量濃度對D315樹脂脫色的影響

粗多糖質量濃度對D315樹脂脫色能力的影響結果如圖2所示。由圖2可知，隨著粗多糖質量濃度的增加，脫色率逐漸降低，而多糖保留率逐漸增加，當質量濃度從2 mg/mL增加至25 mg/mL時，脫色率從85.95%降至73.63%，多糖保留率從79.27%增至86.74%。當樣品質量濃度在10 mg/mL時，脫色率與多糖保留率分別為81.34%、83.77%。因此，粗多糖最適質量濃度為10 mg/mL。

圖2 粗多糖質量濃度對D315樹脂脫色能力的影響Fig.2 Effect of crude polysaccharide mass concentration on decolorization ability of D315 resin

2.2.3 脫色溫度對D315樹脂脫色能力的影響

脫色溫度對D315樹脂脫色能力的影響結果如圖3所示。由圖3可知，隨著脫色溫度的升高，脫色率逐漸增強，當脫色溫度從15℃升至65℃時，脫色率從62.77%提高至83.74%。分析原因可能是溫度增加，導致色素分子的擴散速度加快，從而有利于色素被D315樹脂吸附；脫色溫度在45℃之后，脫色率增加緩慢；并在55℃之后，脫色率趨于穩(wěn)定，為83.29%。保留率隨著溫度的升高，變化不明顯，溫度在15～65℃時，保留率在82.13%～84.21%范圍內。因此，選擇D315樹脂的最佳脫色溫度為55℃。

圖3 脫色溫度對D315樹脂脫色能力的影響Fig.3 Effect of decolorization temperature on decolorization ability of D315 resin

2.2.4 脫色pH值對D315樹脂脫色能力的影響

脫色pH值對D315樹脂脫色能力的影響如圖4所示。由圖4可知，偏酸性環(huán)境更有利于D315樹脂的脫色。當溶液為堿性時，脫色率顯著下降（P＜0.01），當pH＞7.0時，脫色率低于75.39%，當pH=9.0時，脫色率僅為64.74%。這可能是由于堿性環(huán)境使得色素分子性質發(fā)生改變，使得溶液顏色加深，從而脫色率下降。pH值對多糖保留率影響不大，pH值為4.0～9.0時，多糖保留率變化范圍為81.61%～83.57%。因此，選擇D315樹脂的最佳脫色pH值為5.0。

圖4 脫色pH值對D315樹脂脫色能力的影響Fig.4 Effects of decolorization pH value on decolorization rate and polysaccharide retention rate of D315 resin

2.3 灰樹花胞外粗多糖脫色工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以灰樹花粗多糖脫色率（Y1）和保留率（Y2）為評價指標，選取脫色時間（A）、脫色溫度（B）、脫色pH值（C）、粗多糖質量濃度（D）4個因素進行4因素3水平的正交試驗。D315樹脂對灰樹花胞外粗多糖脫色正交試驗結果與分析見表3。

表3 灰樹花胞外粗多糖脫色工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for decolorization process optimization of extracellular crude polysaccharides fromGrifola frondosa

由表3可知，各因素對灰樹花胞外粗多糖脫色率影響的大小順序為A＞B＞D＞C，即脫色時間＞脫色溫度＞粗多糖質量濃度＞脫色pH值。以粗多糖脫色率為評價指標的最佳脫色條件組合為A3B3C2D2，即脫色時間420min，脫色溫度55℃，脫色pH 5.0，粗多糖質量濃度10 mg/mL。在此條件下進行脫色，測得灰樹花胞外粗多糖脫色率為90.61%，多糖保留率為78.23%。各因素對多糖保留率影響的大小順序為D＞A＞B＞C，即粗多糖質量濃度＞脫色時間＞脫色溫度＞脫色pH值。以多糖保留率為評價指標的最佳脫色條件組合為A1B3C2D3。在此條件下進行脫色，測得灰樹花胞外粗多糖的脫色率為86.37%，多糖保留率為79.64%。

結果表明，灰樹花胞外粗多糖脫色的最佳工藝參數為脫色時間420 min、脫色溫度55℃、脫色pH值5.0、樣品質量濃度10 mg/mL。在此條件下進行脫色，測得灰樹花胞外粗多糖的脫色率為90.61%，多糖保留率為78.23%。

2.4 粗多糖對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的測定

脫色前后不同質量濃度的灰樹花胞外粗多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用的影響結果見圖5。由圖5可知，陽性對照阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶具有極強的抑制作用，其質量濃度為10 mg/mL時，抑制率可達66.84%，脫色前后得到的灰樹花胞外粗多糖均能一定程度抑制α-葡萄糖苷酶活性，并且灰樹花胞外粗多糖濃度在10～50 mg/mL范圍內，對α-葡萄糖苷酶的抑制作用與質量濃度呈正相關，脫色前的灰樹花胞外多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率從17.72%增至34.62%，脫色后的灰樹花胞外多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率從24.48%增至58.53%。脫色后的灰樹花胞外粗多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用顯著提高（P＜0.05）。這是由于色素等雜質的存在會阻礙灰樹花胞外多糖對α-葡萄糖苷酶產生抑制作用。另外，利用大孔樹脂處理后的多糖，還能一定程度的去除部分游離蛋白，有利于多糖的提純[11]。通過D315樹脂處理后的灰樹花胞外多糖，達到了較滿意的脫色率和較高的多糖保留率，同時也能一定程度提高其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

圖5 脫色前后的灰樹花胞外粗多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用的影響Fig.5 Effects ofGrifola frondosaextracellular crude polysaccharide before and after decolorization on α-glucosidase inhibition

3 結論

本研究以多糖脫色率和保留率為考察指標，采用靜態(tài)吸附法比較D315、D941、D208、D303、聚酰胺、AB-8、D101、D201樹脂8種樹脂對灰樹花胞外粗多糖的脫色效果，篩選出最適合用于灰樹花胞外粗多糖脫色的大孔樹脂為弱陰離子交換樹脂D315。通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化D315樹脂對灰樹花胞外粗多糖脫色工藝參數為脫色溫度55℃、脫色時間420 min、脫色pH 5.0、粗多糖質量濃度10 mg/mL。在此最優(yōu)脫色條件下，灰樹花胞外粗多糖的脫色率為90.61%，多糖保留率為78.23%，較優(yōu)化前分別提高2.78%、4.12%。脫色前后灰樹花胞外粗多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用結果表明，脫色后的灰樹花胞外多糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用顯著提高（P＜0.05）。灰樹花胞外多糖脫色的工藝研究為其產品的開發(fā)和利用提供一定參考。