蛋白組學(xué)差異揭示黑曲霉（Aspergillus niger）高產(chǎn)檸檬酸的分子機(jī)制

謝 慧，王風(fēng)清，魏東芝*

（1.華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

我國(guó)是檸檬酸生產(chǎn)大國(guó)，占全球市場(chǎng)份額的70%以上，在產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量上均具有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。中國(guó)檸檬酸工業(yè)的強(qiáng)大競(jìng)爭(zhēng)力主要得益于生產(chǎn)菌種具有利用廉價(jià)淀粉類物質(zhì)高產(chǎn)檸檬酸的強(qiáng)大能力[1-2]。菌株（Aspergillus niger）YX-1217是一株典型的檸檬酸高產(chǎn)菌株，能利用玉米粉水解液，在38～39℃發(fā)酵55h產(chǎn)生180.0～200.0g/L檸檬酸。然而A.nigerYX-1217在遺傳上不穩(wěn)定，易于自然衰退，為了保持菌株高檸檬酸產(chǎn)量的特性，必須定期進(jìn)行菌種活化，否則會(huì)衰退為低產(chǎn)檸檬酸菌株（命名為A.nigerYX-1217G），產(chǎn)酸量只有高產(chǎn)菌株的70%，為企業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。

常見的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法包括二維聚丙烯酰胺凝膠電泳（two-dimensionalpolyacrylamide gelelectrophoresis，2-DE）、質(zhì)譜技術(shù)（mass spectrometer，MS）、肽序列標(biāo)簽、蛋白質(zhì)微陣列、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術(shù)以及其他研究蛋白質(zhì)相互作用的方法如酵母雙雜交系統(tǒng)等[4-8]。近年來，由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（appliedbiosystems，ABI）研發(fā)的同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tagsforrelativeandabsolutequantification，iTRAQ）技術(shù)為解決低豐度蛋白質(zhì)的定性及定量研究提供了有效的技術(shù)支持[9-10]。KIM Y等[11]總結(jié)了應(yīng)用于曲霉蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的各種方法和技術(shù)，結(jié)果共鑒定了28個(gè)細(xì)胞表面蛋白，102個(gè)與分泌相關(guān)的蛋白以及139個(gè)胞內(nèi)蛋白，同時(shí)也構(gòu)建了代謝途徑中關(guān)鍵基因的蛋白質(zhì)組圖譜。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)不僅可以用于真菌致病機(jī)理的研究，也可用于絲狀真菌的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)研究。LU X等[12]分別以麥芽糖和木糖為碳源，對(duì)在誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)條件下A.niger的蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較，研究表明，在誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)條件下胞漿蛋白質(zhì)組并沒有明顯的差異，主要差異體現(xiàn)在胞外分泌蛋白，特別是植物細(xì)胞壁降解蛋白。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為工業(yè)菌種改造奠定基礎(chǔ)，為改進(jìn)工業(yè)發(fā)酵過程提供新的途徑[13]。

本研究基于2D-PAGE和iTRAQ這兩種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，將菌株A.nigerYX-1217和菌株YX-1217G的胞外分泌蛋白和胞內(nèi)蛋白進(jìn)行比較，重點(diǎn)分析和檸檬酸產(chǎn)生相關(guān)基因的表達(dá)差異，揭示菌株A.nigerYX-1217生產(chǎn)檸檬酸的高產(chǎn)機(jī)制，并為開發(fā)檸檬酸或其他有機(jī)酸的高產(chǎn)菌株提供新的思路和觀點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

菌株A.nigerYX-1217和A.nigerYX-1217G：濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

尿素、硫脲、Pharmalyte 3-10、TritonX-100、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、丙磺酸、三羥甲基氨基甲烷（trismetyl aminomethane，Tris）、溴酚藍(lán)：美國(guó)Sigma公司；丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺：美國(guó)伯樂公司；固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）膠條（pH 3～10，24 cm）：美國(guó)GE公司。實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基[3]

玉米粉種子培養(yǎng)基：將250 g玉米粉加入1 L水中，攪拌均勻后不斷添加耐高溫α-淀粉酶（40000U/mL），在105℃條件下進(jìn)行液化直到碘指示劑測(cè)試結(jié)果不顯示藍(lán)色，此時(shí)糖度大約為16～18°Bx，獲得玉米粉糖化液即可用作種子培養(yǎng)基。

玉米粉發(fā)酵培養(yǎng)基：將玉米粉糖化液經(jīng)兩層紗布過濾，將過濾的和未過濾的玉米粉糖化液以體積比6∶1混合，混合液即為玉米淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基，測(cè)定總糖質(zhì)量濃度為178.1 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

24孔Minibeadbeater：美國(guó)Biospec公司；IP Gphor等電聚焦電泳系統(tǒng)、Ettan DALT Six SDS-PAGE垂直電泳系統(tǒng)：美國(guó)GE Healthcare公司；5415D臺(tái)式高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；4800Plus基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間-質(zhì)譜（matrix-assistedlaserdesorption/ionization-timeofflightmass spectrometry，MALDI-TOF-MS）：美國(guó)AB Sciex公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 2D-PAGE實(shí)驗(yàn)方案

2D-PAGE的實(shí)驗(yàn)方案在參考文獻(xiàn)[6-8]的基礎(chǔ)上做了修改，等電聚焦運(yùn)行參數(shù)為水化：50 V 10 h；梯度等電聚焦：100V1h、200V1h、500V1h、1000V1h；升壓程序：10000V 1 h、10 000 V 100 000 V·h、500 V 10 h。

1.3.2 iTRAQ實(shí)驗(yàn)方案

iTRAQ實(shí)驗(yàn)方案見參考文獻(xiàn)[9-10]。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)分析的樣本為黑曲霉（A.niger），UniProt數(shù)據(jù)庫中關(guān)于A.niger蛋白質(zhì)的記錄只有9個(gè)，而美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）匹配到的條目較多，一般來說，數(shù)據(jù)庫越大，能夠匹配和鑒定到的蛋白質(zhì)就越多。因此，本次使用數(shù)據(jù)庫為A.nigerNCBInr+Uniport合庫（28 953條序列）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株A.nigerYX-1217和YX-1217G生長(zhǎng)特性與檸檬酸產(chǎn)量比較

菌株A.nigerYX-1217和YX-1217G在玉米粉發(fā)酵液中35℃培養(yǎng)60 h，發(fā)酵結(jié)果如表1所示。

表1 兩株菌在35℃發(fā)酵60 h的生物量、殘?zhí)且约皺幟仕岷勘容^Table 1 Comparison of biomass,residual sugar,citric acid concentration of the two strains at 35℃for 60 hg/L

菌株A.nigerYX-1217是一株典型檸檬酸高產(chǎn)工業(yè)菌株，發(fā)酵60 h時(shí)檸檬酸產(chǎn)率可高達(dá)3.0 g/（L·h），此時(shí)產(chǎn)量為180.0 g/L，而殘?zhí)橇恐挥?.5 g/L。與之相比，退化菌株YX-1217G在發(fā)酵60 h時(shí)檸檬酸產(chǎn)率只有1.1 g/（L·h），檸檬酸產(chǎn)量為65.0 g/L，而發(fā)酵液殘?zhí)橇繛?3.8 g/L，其檸檬酸生產(chǎn)能力與菌株YX-1217相比下降了64%?？傊?，菌株YX-1217的檸檬酸產(chǎn)量比菌株YX-1217G多115 g/L，同時(shí)細(xì)胞干質(zhì)量比其少15 g/L。菌株YX-1217G檸檬酸產(chǎn)量低的原因不僅由于發(fā)酵末期發(fā)酵液中還原糖沒有被徹底消耗，且消耗的還原糖很大程度上來用于增加菌體的生物量。兩株來源相同的菌，由于菌株退化而導(dǎo)致檸檬酸產(chǎn)量有較大差異，因此這兩株菌是利用蛋白組學(xué)分析A.niger檸檬酸高產(chǎn)機(jī)制的好樣本。

2.2 基于2-DE分析A.nigerYX-1217和A.nigerYX-1217G胞外分泌蛋白差異

基于二維電泳技術(shù)分析不同樣本之間（菌株A.niger YX-1217和菌株A.nigerYX-1217G）胞外分泌蛋白差異，通過SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫分析，獲得6個(gè)差異明顯的蛋白，各點(diǎn)在2-DE圖中的位置如圖1所示。

圖1 基于2-DE的菌株YX-1217和菌株YX-1217G胞外分泌蛋白比較Fig.1 Comparison of extracellular protein between strain YX-1217 and strain YX-1217G based on 2-DE

從膠上摳取差異蛋白點(diǎn)，用基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）進(jìn)行分析，各差異蛋白的具體信息見表2。

表2 菌株YX-1217和菌株YX-1217G樣本間差異蛋白分析Table 2 Analysis of differential proteins between strain YX-1217 and strain YX-1217G

由表2可知，6個(gè)差異蛋白都為水解蛋白酶，且都具有豐度＞5-fold的明顯差異（P＜0.05）。

（1）spot 1（酸性α-淀粉酶）：玉米粉液化pH為5.8～6.2，而A.niger利用淀粉液化液發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸時(shí)，其pH迅速?gòu)?.0左右降至2.5。菌株A.nigerYX-1217可分泌大量的酸性α-淀粉酶，和菌株A.nigerYX-1217G相比，其差異倍數(shù)（Fold-change）為15.6。耐酸性α-淀粉酶在低pH值的條件下，隨機(jī)切斷淀粉分子內(nèi)的α-1,4糖苷鍵，生成低聚糖、麥芽糖和糊精等，使淀粉黏度下降[14]。所以菌株A.nigerYX-1217更能充分利用玉米淀粉液化液，并在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。

（2）spot 2,3（葡糖糖化酶）：該酶能水解液態(tài)淀粉中的α-1,4-糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵。水解過程中，從底物分子中的非還原端開始，逐步水解出葡萄糖。當(dāng)菌株A.nigerYX-1217生產(chǎn)檸檬酸時(shí)，其玉米淀粉的預(yù)處理過程只需要加入α-淀粉酶進(jìn)行液化，而不需要額外加入葡糖淀粉酶進(jìn)行糖化，因?yàn)樵摼昴芊置诖罅刻腔?，和菌株A.nigerYX-1217G相比，其差異倍數(shù)（Fold-change）分別為11.3和10.5。因此不僅原料利用更充分，且節(jié)約成本。

（3）spot 4（精氨酸蛋白酶）：肽鏈內(nèi)切酶，能水解蛋白質(zhì)類底物，參與機(jī)體的新陳代謝及生物調(diào)控作用。它的活性中心由兩個(gè)催化性天冬氨酸殘基組成。菌株A.niger YX-1217G可分泌大量的精氨酸蛋白酶，和菌株A.niger YX-1217相比，其差異倍數(shù)（Fold-change）為15.4。

（4）spot 5（酰胺酶）和spot 6（幾丁質(zhì)酶）：都為胞外水解酶類，和A.nigerYX-1217G相比，菌株A.nigerYX-1217分泌量較高，其差異倍數(shù)（fold-change）分別為7.1與5.3。能快速講解胞外物質(zhì)，使原料利用更加充分。

總之，和菌株A.nigerYX-1217G相比，菌株A.niger YX-1217具有更強(qiáng)大的胞外水解酶系統(tǒng)，能夠?qū)⒂衩追鬯庖嚎焖?、徹底的水解成葡萄糖等糖類，為菌株提供充分碳源，這是該菌株檸檬酸高產(chǎn)的主要原因之一。

但是由于菌株A.nigerYX-1217產(chǎn)生酸性α-淀粉酶、葡糖糖化酶豐度較高，使得低豐度蛋白的獲取存在一定困難，獲取的蛋白點(diǎn)數(shù)較少，在一定程度上限制了菌株A.niger YX-1217分泌蛋白組的研究。

2.3 基于iTRAQ技術(shù)分析菌株A.nigerYX-1217和菌株A.nigerYX-1217G胞內(nèi)蛋白差異

為了直接揭示這些菌株間代謝差異，每一株菌選擇兩個(gè)培養(yǎng)點(diǎn)（10 h和40 h）作為樣品進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，共計(jì)4個(gè)樣品，分別是菌株A.nigerYX-1217-10 h（S1-10），菌株A.nigerYX-1217-40 h（S1-40），菌株A.nigerYX-1217G-10 h（S3-10）菌株A.nigerYX-1217G-40 h（S3-40）。

2.3.1 蛋白質(zhì)鑒定與定量

本研究使用iTRAQ技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)相對(duì)定量，所用的質(zhì)譜儀器是Triple TOF 5600。通過Mascot軟件進(jìn)行分析后，匹配到的譜圖數(shù)量是41330張，其中Unique譜圖數(shù)量為40086張，共鑒定到3 553個(gè)蛋白。當(dāng)?shù)鞍棕S度差異倍數(shù)達(dá)到1.2倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其P值＜0.05時(shí)，視為差異蛋白。

2.3.2 差異蛋白的途徑富集分析

為了探索不同樣本間的代謝差異，將差異蛋白按照京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesand Genomes，KEGG）代謝數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類，尤其是與檸檬酸生物合成相關(guān)的代謝途徑，如糖酵解途徑（embden meyerhof pathway，EMP）、磷酸己糖途徑（hexose monophosphate pathway，HMP）、三羧酸循環(huán)（tricarboxylicacidcycle，TCA）、脂肪酸代謝（fatty acid metabolism，F(xiàn)AM）等。菌株A.niger YX-1217與菌株A.nigerYX-1217G在碳源代謝中的差異表達(dá)分析結(jié)果見表3。

表3 涉及碳源代謝的差異蛋白分析Table 3 Analysis of differential protein involved in carbohydrate metabolism

（1）涉及糖酵解途徑的差異蛋白分析

糖酵解途徑在整個(gè)生長(zhǎng)過程中實(shí)現(xiàn)碳源的初代謝，為菌體提供能量并為菌體生長(zhǎng)的其他代謝和檸檬酸的合成提供必需的底物。由表3可知，糖酵解相關(guān)的一些酶在菌株YX-1217中的表達(dá)量比在菌株YX-1217中明顯增加。己糖的磷酸化由己糖激酶（hexokinase，Hk）和葡萄糖激酶（glucokinase，Gk）共同作用，但是兩種酶的基因彼此孤立，動(dòng)力學(xué)決定性因素也不同。Hk是酵解過程EMP途徑的第一個(gè)酶，是限速酶；而Gk是一個(gè)誘導(dǎo)酶，二者都能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate，G-6-P）。在菌株YX-1217中，兩個(gè)酶的表達(dá)量在10 h階段明顯增加，差異倍數(shù)分別為1.912和1.581，但是當(dāng)發(fā)酵40 h時(shí)，Gk的蛋白差異不明顯。6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（glucose-6-phosphate isomerase，Gpi）是EMP途徑的第二個(gè)酶，能將G-6-P轉(zhuǎn)化成F-6-P，在YX-1217菌株中，該酶的表達(dá)量在發(fā)酵10 h和發(fā)酵40 h均明顯上調(diào)，差異倍數(shù)分別為1.759和1.453。磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，Pfk）在YX-1217菌株中明顯下調(diào)，表達(dá)量低于菌株YX-1217G。該酶受到檸檬酸的抑制，這種抑制可以被NH4+和高濃度無機(jī)磷酸鹽解除。研究表明，在菌株A.niger中檸檬酸的積累伴隨胞內(nèi)NH4+濃度的增加，從而解除了檸檬酸對(duì)Pfk的抑制[15-16]。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenas，Gpd）是糖酵解途徑、檸檬酸循環(huán)以外的另一個(gè)葡萄糖分解途徑-磷酸戊糖途徑中的第一個(gè)酶，它催化6-磷酸葡萄糖脫氫形成6-磷酸葡糖酸。以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）為電子受體，整個(gè)反應(yīng)的平衡是趨向于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的生成。該酶在菌株YX-1217中表達(dá)量明顯上調(diào)，與菌株YX-1217G相比，差異倍數(shù)為1.647和1.445。

（2）涉及檸檬酸循環(huán)的差異蛋白分析

丙酮酸羧化酶（pyruvatecarboxylase，Pc）存在于線粒體中，是催化如下不可逆反應(yīng)的關(guān)鍵性酶：丙酮酸+CO2+三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）+H2O→草酰乙酸+二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）+磷酸。在TCA循環(huán)中，它是供給草酰乙酸的主要補(bǔ)充反應(yīng)，而草酰乙酸是生成檸檬酸的重要前體之一。由表3可知，在菌株YX-1217中，Pc的表達(dá)量明顯增加，與菌株YX-1217G相比，差異倍數(shù)分別為2.303和2.001。檸檬酸是TCA循環(huán)中一種重要的中間體，而檸檬酸合成酶（citrate synthase，Cs），作為第一步反應(yīng)的限速酶，可以催化草酰乙酸和乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA）縮合形成檸檬酸，是檸檬酸生產(chǎn)中最重要的酶[17-18]。本研究鑒定出3種檸檬酸合酶Cs，這3種酶在菌株YX-1217中表達(dá)量普遍明顯增加，差異倍數(shù)分別為1.617、2.013和2.532。作為檸檬酸生產(chǎn)過程中最關(guān)鍵的酶，該酶在菌株YX-1217中的高效表達(dá)可能是該菌檸檬酸高產(chǎn)的原因之一。然而在菌株YX-1217中，烏頭酸水合酶（aconitate hydratase，Aco）和異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，Idh）表達(dá)量在種子10 h明顯增加，使生成的檸檬酸繼續(xù)參與代謝而被降解，從而不利于檸檬酸的積累，但同時(shí)帶動(dòng)TCA循環(huán)繼續(xù)進(jìn)行，使檸檬酸以后的步驟有被激活的跡象，產(chǎn)生更多的ATP來滿足代謝需求。但是當(dāng)發(fā)酵到40 h時(shí)，蛋白差異不明顯。有報(bào)道稱，在檸檬酸發(fā)酵初期，NAD-和NADP-專一性異檸檬酸脫氫酶具有很高的活性，將檸檬酸通過TCA循環(huán)轉(zhuǎn)化為酮戊二酸，因此檸檬酸積累的最初階段并沒有阻斷TCA循環(huán)[19]。這與得到的結(jié)果一致，高產(chǎn)菌株中高濃度檸檬酸刺激增加順烏頭酸酶的表達(dá)。

（3）涉及脂類代謝的差異蛋白分析

在氧氣充足的條件下，脂肪酸被逐漸分解為乙酰CoA，最終徹底氧化為CO2和H2O，并釋放大量的能量，這是生物體內(nèi)乙酰CoA的主要來源之一。?；鵆oA脫氫酶（acyl-CoA dehydrogenase，Acad）是一類用來催化細(xì)胞線粒體中脂肪酸β-氧化的第一步的重要的酶。由表3可知，其在菌株A.nigerYX-1217中的表達(dá)量比在菌株YX-1217G更高，發(fā)酵10 h差異倍數(shù)分別為1.346和2.266。甘油酯水解酶（esterase/lipase，Lps）隸屬于羧基酯水解酶類，能夠逐步的將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。在菌株A.nigerYX-1217中，Lps表達(dá)量相比在菌株YX-1217G更高，差異倍數(shù)增大到3.373。玉米中脂肪含量3%～5%，菌株A.nigerYX-1217在甘油酯水解酶的作用下，玉米淀粉液化液中的脂肪被降解為甘油和脂肪酸，脂肪酸再進(jìn)一步進(jìn)行β-氧化，最終生成乙酰CoA，作為檸檬酸生產(chǎn)的前體物質(zhì)。

（4）涉及能量代謝的差異蛋白分析

生化代謝過程，如糖酵解、三羧酸循環(huán)和β-氧化，都會(huì)產(chǎn)生還原型輔酶NADH。此輔酶含有高電極電勢(shì)的電子，這些電子從NADH釋放出來，并通過一系列的酶?jìng)鬟f給氧氣，最后以ATP的形式釋放出大量能量。呼吸鏈相關(guān)差異蛋白結(jié)果如表4。由表4可知，許多呼吸鏈相關(guān)蛋白在菌株YX-1217中表達(dá)量明顯增強(qiáng)，主要包括V型質(zhì)子三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATPase）的三個(gè)亞基A、B、E，和菌株YX-217G相比表達(dá)量增加，10 h的差異倍數(shù)分別為1.313、1.666、1.582。10 h的細(xì)胞色素b5、b-C1、C蛋白在菌株YX-1217中表達(dá)量增加，差異倍數(shù)分別為1.553、1.335、1.365。菌株YX-1217中標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈的蛋白及三磷酸腺苷酶的表達(dá)量增加，使得該菌株呼吸作用增強(qiáng)，在高產(chǎn)檸檬酸時(shí)提供維持生命的基本動(dòng)力。

表4 涉及能量代謝的差異蛋白分析Table 4 Analysis of differential protein involved in energy metabolism

（5）菌株A.nigerYX-1217高產(chǎn)CA相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控

為了闡明CA高產(chǎn)的機(jī)制，根據(jù)與CA生產(chǎn)的直接相關(guān)性，研究了菌株A.nigerYX-1217碳源代謝途徑的表達(dá)調(diào)控，如圖2所示。

圖2 兩株黑曲霉高產(chǎn)檸檬酸相關(guān)基因在10 h與40 h的表達(dá)調(diào)控Fig.2 Expression regulation of genes involving high yield citric acid in twoA.nigerstrains at 10 h and 40 h

由圖2可知，菌株A.nigerYX-1217中大多數(shù)和CA產(chǎn)生相關(guān)關(guān)鍵基因的表達(dá)水平顯著高于YX-1217G的表達(dá)水平。在高產(chǎn)菌株中，葡萄糖首先經(jīng)糖酵解途徑生成丙酮酸；其次丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下生成草酰乙酸，為檸檬酸提供前體物質(zhì)，且脂肪酸代謝為檸檬酸的產(chǎn)生提供另一個(gè)前體物質(zhì)乙酰輔酶A，二者在檸檬酸合酶的作用下生成檸檬酸；糖酵解途徑、脂肪酸代謝及三羧酸循環(huán)過程中生成的NADH和NADPH經(jīng)呼吸鏈轉(zhuǎn)化為NAD+/NADP+，確保細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)和能量代謝的平衡，否則由葡萄糖轉(zhuǎn)化為CA的代謝就會(huì)停止?？傊?，豐富的水解酶系、不受阻礙地中心代謝流、強(qiáng)大的電子傳遞鏈可能是A.niger YX-1217檸檬酸高產(chǎn)的原因。

3 結(jié)論

基于二維聚丙烯酰胺電泳（2-DE）分析菌株A.niger YX-1217和菌株A.nigerYX-1217G胞外分泌蛋白差異。質(zhì)譜分析了6個(gè)差異明顯的水解蛋白，分別是酸性α-淀粉酶（An04g09890）、葡糖糖化酶（An14g02760、An04g06920）、精氨酸蛋白酶（An07g00950）、酰胺酶（An12g01020）和幾丁質(zhì)酶（An05g01800）。菌株A.nigerYX-1217能分泌大量的胞外水解蛋白，使其主要原料——玉米淀粉液化液被充分利用，在發(fā)酵過程中使原料從濃稠變得稀薄，菌株長(zhǎng)勢(shì)良好，產(chǎn)酸率提高。

將差異蛋白按照KEGG代謝數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類，結(jié)果顯示與檸檬酸生物合成相關(guān)的酶在菌株A.nigerYX-1217中表達(dá)量顯著增加，如丙酮酸羧化酶（An04g02090）、檸檬酸合成酶（An15g01920）、甘油酯水解酶（An09g06390）、?；鵆oA脫氫酶（An17g01150）、V-型質(zhì)子三磷酸腺苷酶亞基B（An02g02020）等。這些蛋白涉及糖酵解代謝、TCA循環(huán)、脂類代謝與能量代謝，這些蛋白的高效表達(dá)，是菌株A.niger YX-1217高產(chǎn)檸檬酸的原因之一。