響應(yīng)面法優(yōu)化茯苓多糖發(fā)酵培養(yǎng)基

鄒成梅，王甜甜，何思艷，田珍燕，鄭永良，占劍峰，王蔚新，吳 鵬*

（黃岡師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室 大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000）

茯苓（Poria cocos），是擬層孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，常寄生在松樹根上，形如甘薯，球狀，外皮淡棕色或黑褐色，內(nèi)部粉色或白色[1]。茯苓的藥用部位是茯苓菌核，茯苓多糖是茯苓的主要有效成分[2-3]。茯苓多糖分為水溶性多糖和堿溶性多糖，不溶于乙醇、丙酮和乙醚，其結(jié)構(gòu)是50個β-（1→3）結(jié)合的葡萄糖單位，每個β-（1→5）結(jié)合的葡萄糖基支鏈與l～2個β-（1→6）結(jié)合的葡萄糖基間隔[6-7]。

經(jīng)過多年的發(fā)展，茯苓已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及保健食品領(lǐng)域方面，茯苓多糖的消耗也日趨增大，茯苓多糖提取的工藝也在不斷優(yōu)化[8-9]。茯苓的生產(chǎn)可分為固體培養(yǎng)與液體發(fā)酵，國內(nèi)多采用固體培養(yǎng)茯苓，以此來提取多糖，但該法存在木材消耗大、產(chǎn)量不高、生產(chǎn)周期較長等諸多問題。而液體發(fā)酵能夠連續(xù)地大規(guī)模進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，大大縮短生產(chǎn)時間[10]，液體發(fā)酵也可通過工藝控制，使微生物在最適宜的溫度、酸堿度、溶氧水平和碳氮比等條件下生長，使其新陳代謝旺盛，在短期內(nèi)獲得大量預(yù)期的代謝產(chǎn)物。因此，國內(nèi)外采用液體發(fā)酵來獲得茯苓多糖的方式，已成為現(xiàn)在工業(yè)化生產(chǎn)的新方向。廖彥[11]在6 L發(fā)酵罐中液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，茯苓菌生物量、胞內(nèi)外多糖含量均于第11天達(dá)到最大值，分別為3.44 g/L、17.25 mg/g、1.58 g/L；李羿等[12]探討了茯苓搖瓶補(bǔ)料和發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng)的發(fā)酵工藝，在5 L發(fā)酵罐發(fā)酵中，茯苓多糖的產(chǎn)量達(dá)到0.23mg/mL。但目前茯苓多糖產(chǎn)量均無法達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求。

本研究采用PB試驗[13-16]和響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）優(yōu)化[17-19]茯苓產(chǎn)粗多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基組分，以期提高茯苓粗多糖的產(chǎn)量。通過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)茯苓粗多糖，在一定程度上節(jié)約成本，提高發(fā)酵效率，為體外研究多糖成分抗氧化活性提供基礎(chǔ)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

茯苓（Poria cocos）：黃岡九資河。

葡萄糖、硝酸鈉、無水氯化鈣、維生素B1（vitamin B1，VB1）（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母粉（生化試劑）：上海瑞永生物科技有限公司；蛋白胨、瓊脂粉（均為生化試劑）：生工生物工程（上海）股份有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎂（分析純）：天津博迪化工股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

普通固體培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨7.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，瓊脂粉20 g/L，121℃條件下滅菌20 min。

種子液體培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨7.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，121℃條件下滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母粉5 g/L，硫酸鎂1.67 g/L，蛋白胨30 g/L，硝酸鈉5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，VB11 g/L，無水氯化鈣0.1 g/L，121℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）股份有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；LX-B50L型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；RB-CJ-1ND型超凈工作臺：北京瑞邦興業(yè)科技有限公司；SPX-150生化培養(yǎng)箱：中儀國科（北京）科技有限公司；TG16-WST臺式高速離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FD系列冷凍干燥機(jī)：上海拓紛機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化、純化及培養(yǎng)條件

活化：采用無菌移液槍吸取2%的茯苓菌種于種子液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行液體發(fā)酵，在26.5℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。

篩選及純化：將活化的菌種分梯度稀釋，用無菌移液槍吸取活化好的菌液1mL，放入9mL的無菌水中即為10-1稀釋液，如此重復(fù)，依次制成10-2～10-8的稀釋液，將10-5～10-84管稀釋液各取0.2 mL，接種于普通固體培養(yǎng)基中，26.5℃條件下培養(yǎng)，挑選好的單菌落通過劃線法再次得到純種，單個純種斜面培養(yǎng)3 d，挑取菌種于種子液培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，測定菌株的茯苓粗多糖產(chǎn)量，挑選產(chǎn)量最高的菌種進(jìn)行培養(yǎng)和后續(xù)試驗。

種子液：按2%接種量接種于種子液體培養(yǎng)基中，于26.5℃溫度下，液體發(fā)酵3 d，得種子液，并保種冷藏。

發(fā)酵培養(yǎng)：按2%的接種量，將種子液接種于50 mL的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26.5℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

1.3.2 茯苓粗多糖產(chǎn)量的測定

將培養(yǎng)3d后的50mL菌液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至15mL，加入40 mL的體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液醇沉，過濾后在沉淀中加入60 mL的蒸餾水，放入離心管中，經(jīng)3 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀中再加入20 mL蒸餾水，繼續(xù)離心10 min，棄上清，將沉淀置于培養(yǎng)皿中，真空干燥24 h，稱質(zhì)量，得到茯苓粗多糖。

1.3.3 Plackett-Burman試驗設(shè)計

Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計是響應(yīng)面試驗設(shè)計的一種，用于中心組合試驗之前挑選優(yōu)化因素的一種試驗設(shè)計方法。參考文獻(xiàn)[20-22]，選擇影響茯苓粗多糖產(chǎn)量的8個因素葡萄糖（A）、酵母粉（B）、蛋白胨（C）、硝酸鈉（D）、磷酸二氫鉀（E）、硫酸鎂（F）、VB1（G）和無水氯化鈣（H），以茯苓粗多糖產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，選取N=12的PB試驗設(shè)計對影響茯苓粗多糖產(chǎn)量的8個因素的顯著性進(jìn)行考察，將每個因素分為高（+1）、低（-1）2個水平，其中高水平是低水平的1.5倍。PB試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

1.3.4 最陡爬坡試驗設(shè)計

在PB試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)各因素的效應(yīng)值來選擇合適的步長，用來快速找出最佳區(qū)域，變化方向均由效應(yīng)值的正負(fù)確定，正效應(yīng)的因素應(yīng)取低值依次增大，負(fù)效應(yīng)的因素應(yīng)取高值依次減小。經(jīng)最陡爬坡試驗得到茯苓粗多糖產(chǎn)量的因素拐點，作為下一步響應(yīng)面分析的中心點。

1.3.5 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計

根據(jù)最陡爬坡試驗的結(jié)果，得到Box-Behnken試驗的中心點，以相鄰的上下兩個實際步長為高低水平，以茯苓粗多糖產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，對茯苓粗多糖產(chǎn)量的影響因素葡萄糖（X1）、酵母粉（X2）、硫酸鎂（X3）進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗，得到最優(yōu)方案。響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗結(jié)果

按PB試驗設(shè)計進(jìn)行試驗，PB試驗設(shè)計與結(jié)果見表3，各因素主效應(yīng)分析試驗結(jié)果見表4。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗的效應(yīng)分析Table 4 Effect analysis of Plackett-Burman experiments

由表4可知，8個因素中貢獻(xiàn)值最大的3個因素分別是葡萄糖、硫酸鎂和酵母粉，其可信度均在95%以上，對結(jié)果呈顯著影響（P＜0.05）。因此，選擇葡萄糖、硫酸鎂和酵母粉添加量作為主要影響因素進(jìn)行下一步試驗。

2.2 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

經(jīng)過PB試驗后，選擇3個主要效應(yīng)因素葡萄糖（X1）、酵母粉（X2）、硫酸鎂（X3）進(jìn)行最陡爬坡試驗，確定最佳水平范圍，最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

由表5可知，當(dāng)葡萄糖添加量為50 g/L、酵母粉添加量為20 g/L和硫酸鎂添加量為2.0 g/L時，茯苓粗多糖產(chǎn)量最高，因此選擇第4組試驗作為Box-Behnken試驗的中心點，進(jìn)行Box-Behnken試驗。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計Table 5 Design of the steepest climbing experiments

2.3 響應(yīng)面試驗優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

在PB試驗和最陡爬坡試驗基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件，以茯苓粗多糖產(chǎn)量（Y）作為響應(yīng)值，對葡萄糖（X1）、酵母粉（X2）和硫酸鎂（X3）添加量3個因素進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗，Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表6，回歸模型方差分析結(jié)果見表7。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

運用Design-Expert8.0軟件對各因素進(jìn)行二次多項式回歸擬合后，得到茯苓粗多糖產(chǎn)量高低響應(yīng)面回歸模擬方程：

由表7可知，該回歸模型的影響極顯著（P＜0.01），其中X1對響應(yīng)值的影響顯著（P＜0.05），X1X2、X12、X22對響應(yīng)值的影響極顯著（P＜0.01），其他項影響均不顯著（P＞0.05）。失擬項P值為0.568 7＞0.05，不顯著，表明模型符合實際情況，可以用此模型對茯苓粗多糖的產(chǎn)量進(jìn)行分析和預(yù)測。

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

2.3.2 響應(yīng)面分析及驗證

應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件獲得葡萄糖、酵母粉、硫酸鎂添加量3個因素交互作用對茯苓粗多糖產(chǎn)量影響的響應(yīng)面和等高線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，葡萄糖與酵母粉交互作用等高線中心區(qū)域呈橢圓形，表明兩因素存在明顯的交互作用。所有響應(yīng)面圖形坡面陡峭，方程的拋物線圖形開口全部向下，即最大值存在，響應(yīng)面覆蓋最大值所在區(qū)域。

根據(jù)回歸模擬方程可以算出茯苓粗多糖產(chǎn)量的最大預(yù)測值為142.5 mg/100 mL，此時培養(yǎng)基的主要成分及添加量為：葡萄糖47.12 g/L、酵母粉20.53 g/L、硫酸鎂1.81 g/L、蛋白胨30 g/L、硝酸鈉5 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、VB11 g/L、無水氯化鈣0.1g/L。為方便實際操作，修改培養(yǎng)基成分為葡萄糖47.1g/L、酵母粉20.5g/L、硫酸鎂1.8 g/L、蛋白胨30 g/L、硝酸鈉5 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、VB11 g/L、無水氯化鈣0.1g/L。按此培養(yǎng)基成分進(jìn)行試驗，得到茯苓粗多糖的產(chǎn)量為138 mg/100 mL，與模型預(yù)測值相接近，較初始發(fā)酵培養(yǎng)基，茯苓粗多糖是優(yōu)化前的1.3倍。

圖1 葡萄糖、酵母粉和硫酸鎂添加量交互作用對茯苓粗多糖產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between glucose,yeast powder and magnesium sulfate addition on the yield of crude polysaccharide fromPoria cocos

3 結(jié)論

根據(jù)PB試驗結(jié)果從8個因素中選擇了具有重要效應(yīng)的3個因素葡萄糖、酵母粉和硫酸鎂作為主要影響因素。經(jīng)過Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析，對培養(yǎng)基的組分優(yōu)化，確定了最優(yōu)培養(yǎng)基成分為：葡萄糖47.1 g/L、酵母粉20.5 g/L、硫酸鎂1.8 g/L、蛋白胨30 g/L、硝酸鈉5 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、VB11 g/L、無水氯化鈣0.1 g/L。在此最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，茯苓粗多糖產(chǎn)量為138 mg/100 mL，是優(yōu)化前（102 mg/100 mL）的1.3倍。