黃酒中生物胺對(duì)小鼠胺類(lèi)氧化酶和免疫功能的影響

周瑋忻，伍梓汐，萬(wàn) 群，程如越，沈 曦，李 鳴，張 明，陳歷水，劉 蕾，何 方*

（1.四川大學(xué) 華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 成都 610041；2.北京工商大學(xué) 食品學(xué)院，北京 100048；3.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院 食品研發(fā)中心，北京 100020）

黃酒是我國(guó)特有的低度飲料酒，距今已有5 000多年的歷史，與啤酒、葡萄酒統(tǒng)稱(chēng)為世界三大釀造酒。黃酒中有豐富的氨基酸、多酚和低聚糖等活性物質(zhì)，能增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化、保護(hù)心血管等，但大量的氨基酸可能導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程微生物作用而產(chǎn)生生物胺（biogenic amine，BA）[1-2]。

生物胺是一類(lèi)含氮堿性化合物，黃酒中的生物胺主要包括酪胺、組胺、腐胺、尸胺、β-苯乙胺、色胺、精胺等[3]。少量生物胺具有一定的生理功能，但機(jī)體攝入高生物胺含量的食品或不充分代謝會(huì)導(dǎo)致生物胺積累，引起血壓升高、頭痛、心悸等毒性作用[4-5]。發(fā)酵食品中的生物胺主要由某些微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶而成，正常情況下，哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)有單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）和多胺氧化酶等代謝生物胺的解毒酶系統(tǒng)，但遺傳導(dǎo)致胺類(lèi)氧化酶缺乏或外界因素引起胺類(lèi)氧化酶活性降低，均會(huì)增加人體對(duì)生物胺的敏感性。有研究稱(chēng)低于10%的乙醇含量可以增加脫羧酶的活性，而12%的乙醇還會(huì)抑制91%的胺類(lèi)氧化酶活性[6-8]，同時(shí)乙醇還會(huì)增大小腸壁吸收生物胺的通透性，所以酒精飲料中更應(yīng)注重生物胺的含量及其毒性作用。黃酒中生物胺含量遠(yuǎn)高于葡萄酒和啤酒[9-10]，雖然有很多關(guān)于黃酒中生物胺含量的測(cè)定研究，但由于不同生物胺有不同的毒性以及它們之間的相加和協(xié)同作用、機(jī)體解毒酶活性、個(gè)體差異等，生物胺的毒性閾值很難確定[11]，目前還沒(méi)有國(guó)家出臺(tái)黃酒中生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)。

隨著生活水平的提高和消費(fèi)者自我保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，人們對(duì)食品安全的要求越來(lái)越高。通過(guò)對(duì)受試小鼠單胺氧化酶、二胺氧化酶活性的測(cè)定和免疫因子的檢測(cè)，對(duì)黃酒及生物胺的安全性進(jìn)行探討，初步評(píng)估黃酒及其生物胺對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響，為規(guī)范黃酒生產(chǎn)工藝和生物胺含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

黃酒由北京中糧集團(tuán)有限公司提供，酒精度為19.55%vol，總生物胺含量為106.24 mg/L，最高的三種分別是腐胺45.62 mg/L、色胺33.81 mg/L、酪胺15.79 mg/L，-4℃保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體（specific pathogenfree，SPF）級(jí)雄性昆明種小鼠，60只，4周齡（體質(zhì)量18～20 g），購(gòu)于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所［許可證號(hào)：SCXK（川）2013-15］。昆明小鼠于本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境喂養(yǎng)，自由飲水和攝食。

1.1.3 主要試劑

腐胺、色胺、酪胺標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；單胺氧化酶、二胺氧化酶、蛋白定量測(cè)試盒均來(lái)自南京建成生物工程研究所；免疫因子檢測(cè)試劑盒：R&D公司Luminex Assay系列（96孔）。

1.2 儀器與設(shè)備

Chemray 240全自動(dòng)生化分析儀：深圳雷杜生命科技有限公司；752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；VCX 130超聲波細(xì)胞破碎儀：SONICS公司；CX31光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS公司；Luminex LX-200分析儀：R&D公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3個(gè)對(duì)照組（空白對(duì)照組、酒精對(duì)照組、BA對(duì)照組）和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組（黃酒組、黃酒+9倍BA組、黃酒+99倍BA組），每組10只。每日每只的灌胃量如下：

空白對(duì)照組灌胃0.2 mL生理鹽水；酒精對(duì)照組的灌胃量根據(jù)中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量（2016版）中成人（60 kg）每日最高可攝入的酒精量（30 g）換算，以0.5 mg/g小鼠體質(zhì)量（以下表示為mg/g）的酒精進(jìn)行灌胃；黃酒組與酒精對(duì)照組具有相同的酒精灌胃量，以2.56 mg/g的黃酒進(jìn)行灌胃；BA對(duì)照組與黃酒組具有相同的腐胺、色胺、酪胺灌胃量，以腐胺1.23×10-4mg/g+色胺8.86×10-5mg/g+酪胺4.29×10-5mg/g進(jìn)行灌胃；黃酒+9倍BA組是以9倍BA對(duì)照組的生物胺劑量添加到與黃酒組同劑量的黃酒中；黃酒+99倍BA組是以99倍BA對(duì)照組的生物胺劑量添加到與黃酒組同劑量的黃酒中。

小鼠每周稱(chēng)質(zhì)量一次，根據(jù)體質(zhì)量變化每周更換一次灌胃試劑量，以水為溶劑，保證灌胃量均為0.2 mL/（只·d），連續(xù)灌胃30 d。

1.3.2 取材及檢測(cè)

受試小鼠于第30天灌胃后，禁食不禁水。12h后用眼球摘除法取血，置于離心管，室溫靜置1 h后，3 000 r/min離心10 min分離血清，取上清液，再以3 000 r/min，1 min進(jìn)行二次離心，收集上清液于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。小鼠脫頸處死后，迅速解剖腹部和頭部，取肝大葉中心部位，用生理鹽水沖洗，放入4%中性多聚甲醛固定24 h，制作石蠟切片，并用蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察；同時(shí)將大腦、小腸和剩下的肝臟凍存于-80℃冰箱待檢。

根據(jù)二胺氧化酶測(cè)試盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清和小腸組織中DAO活性；參照蛋白定量測(cè)試盒和單胺氧化酶測(cè)試盒的說(shuō)明書(shū)操作，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)肝臟和大腦中MAO活性。參照Luminex Assay免疫因子測(cè)試盒操作，用LuminexLX-200分析儀測(cè)定血清的白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-12、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和干擾素（interferon，IFN）-γ。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)于符合方差分析條件的數(shù)據(jù)，結(jié)果用xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（兩兩比較采用SNK法或LSD法）；對(duì)于分布不明的數(shù)據(jù)，結(jié)果用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，多組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis單因素方差分析。當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠的胺類(lèi)氧化酶活性

2.1.1 小鼠大腦、肝臟MAO活性

正常情況下，單胺氧化酶是一類(lèi)黃素蛋白，主要分布于肝、腦等器官的線(xiàn)粒體中，能夠選擇性催化生物胺和神經(jīng)遞質(zhì)的代謝[12]。MAO在腦神經(jīng)組織中積累過(guò)多，就會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的胺代謝產(chǎn)物，而這些產(chǎn)物被認(rèn)為是引起各類(lèi)精神疾病的重要原因[13]。早有報(bào)道[14-15]指出，MAO可作用于中樞系統(tǒng)和神經(jīng)末梢組織，其活性異常可能與帕金森氏病、抑郁、阿爾茨海莫氏癥等疾病相關(guān)，所以MAO活性可反映機(jī)體生理狀態(tài)。各組小鼠大腦和肝臟MAO活性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠大腦和肝臟單胺氧化酶活性的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of monoamine oxidase activities of brain and liver in the tested mice U/mg

由表1可知，酒精對(duì)照組和BA對(duì)照組的大腦MAO活性均高于空白對(duì)照組（P＜0.05），黃酒+9倍BA組和黃酒+99倍BA組大腦MAO活性均高于黃酒對(duì)照組（P＜0.05），而黃酒對(duì)照組與空白對(duì)照組大腦MAO活性的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；黃酒對(duì)照組大腦MAO活性低于酒精對(duì)照組（P＜0.05），而黃酒+9倍BA組和黃酒+99倍BA組與酒精對(duì)照組的大腦MAO活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），推測(cè)酒精和生物胺單獨(dú)作用均引起大腦MAO升高，黃酒可能對(duì)低劑量生物胺和酒精引起的大腦MAO活性升高具有一定的保護(hù)作用，當(dāng)黃酒中生物胺含量達(dá)到10倍和100倍時(shí)，能明顯引起大腦MAO活性的升高，同時(shí)指出黃酒的保護(hù)作用隨生物胺含量不同是有限度的。BA對(duì)照組的肝臟MAO活性低于空白對(duì)照組（P＜0.05），而3個(gè)實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組的肝臟MAO活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示生物胺單獨(dú)作用能引起肝臟MAO活性略微降低，但與黃酒共同作用時(shí)（100倍劑量為止），未引起肝臟MAO活性的明顯變化。大腦、肝臟的測(cè)定結(jié)果說(shuō)明適量飲用該黃酒不會(huì)引起機(jī)體MAO活性明顯的變化，同時(shí)本次實(shí)驗(yàn)中酒精未表現(xiàn)出抑制肝臟MAO活性，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)投用酒精量較少，尚不足以引起MAO活性改變。

2.1.2 小鼠血清、小腸DAO活性

DAO在體內(nèi)主要分布于小腸粘膜，血清中含量極少，主要作用于外源性或內(nèi)源性組胺的氧化脫氫[16]。當(dāng)小腸粘膜受到損傷或屏障功能衰退時(shí)，胞內(nèi)釋放DAO增加，進(jìn)入血液、腸間隙等，引起血清DAO升高；其次，壞死腸粘膜細(xì)胞會(huì)脫落從而引起小腸粘膜組織DAO下降[17-18]，故小腸和血清DAO活性可反映小腸粘膜完整性和功能性。各組小鼠血清和小腸DAO活性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清和小腸二胺氧化酶活性的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of diamine oxidase activities of blood serum and small intestine in the tested mice U/L

由表2可知，與空白對(duì)照組相比，本實(shí)驗(yàn)中各組間受試小鼠的小腸組織和血清DAO活性的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明黃酒中的生物胺（100倍劑量為止）未對(duì)受試小鼠腸粘膜造成嚴(yán)重的刺激。

2.2 小鼠的肝臟病理形態(tài)

病理形態(tài)觀察是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中為了觀察組織是否病變的一種常用手段，有研究表明[19-20]，長(zhǎng)期過(guò)量飲酒對(duì)多種器官，特別是肝臟有直接的毒性作用，其主要機(jī)制是氧化應(yīng)激和炎癥。不同處理組的小鼠肝臟病理形態(tài)觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肝臟病理形態(tài)Fig.1 Pathomorphology of liver of the tested mice

光鏡下觀察可見(jiàn)，空白對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞核大而圓，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞間聯(lián)系緊密；肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列；匯管區(qū)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；未見(jiàn)細(xì)胞變性、腫脹；肝竇和肝細(xì)胞均未見(jiàn)異常。其他各組小鼠肝細(xì)胞、肝細(xì)胞索、肝竇、中央靜脈、匯管區(qū)的細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，和對(duì)照組比未見(jiàn)明顯異常病理改變。提示生物胺或者黃酒的干預(yù)未對(duì)小鼠肝臟造成明顯的傷害，這與以往酒精損傷肝臟的研究不同，可能原因有：一是酒精對(duì)照組的酒精投用劑量是按照膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量（dietaryreference intakes，DRIs）中健康推薦量計(jì)算的，含量在安全范圍內(nèi)；二是研究對(duì)象原料不同，前者研究的是純酒精，而實(shí)驗(yàn)組用的黃酒，黃酒含有酚類(lèi)、谷胱甘肽等活性成分，具有抗氧化作用[21]，能減緩酒精對(duì)肝臟的損害；三是可能與實(shí)驗(yàn)周期有關(guān)。

2.3 小鼠的免疫因子水平

免疫系統(tǒng)細(xì)胞的增殖、分化和功能受到一系列細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。根據(jù)功能細(xì)胞因子可分為白細(xì)胞介素、干擾素和腫瘤壞死因子等，它們通過(guò)合成、分泌及基因表達(dá)來(lái)相互作用、相互影響，從而發(fā)揮免疫功能[22]。各組小鼠血清白細(xì)胞介素的測(cè)定結(jié)果和TNF-α、IFN-γ的測(cè)定結(jié)果分別見(jiàn)表3和表4。

表3 各組小鼠血清白細(xì)胞介素的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of serum interleukin level in the tested mice

表4 各組小鼠TNF-α、IFN-γ的測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results of TNF-α and IFN-γ levels in the tested mice pg/mL

由表3、表4可知，實(shí)驗(yàn)中黃酒+外源性生物胺（100倍劑量為止）未對(duì)除IL-1β外的其他免疫因子指標(biāo)造成明顯影響。IL-1在機(jī)體炎癥、感染、損傷及免疫調(diào)節(jié)等方面扮演重要角色，主要包括IL-1α和IL-1β兩種形式，IL-1α是炎癥發(fā)生的始動(dòng)因子，而IL-1β作為其主要活動(dòng)形式則主導(dǎo)炎癥反應(yīng)的傳播，維持正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[23]。BA對(duì)照組IL-1β含量低于空白對(duì)照組（P＜0.05），黃酒+99倍BA組IL-1β含量比空白對(duì)照組、酒精對(duì)照組和黃酒+9倍生物胺組低（P＜0.05），而黃酒組IL-1β含量與空白對(duì)照組、酒精對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），推測(cè)生物胺單獨(dú)作用能引起小鼠血清IL-1β含量失調(diào)，引起機(jī)體免疫系統(tǒng)功能紊亂，而當(dāng)外源性生物胺與黃酒共同作用時(shí)，生物胺劑量達(dá)到100倍時(shí)才會(huì)引起IL-1β含量明顯變化。

3 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源性生物胺會(huì)引起大腦MAO活性升高、肝臟MAO活性下降、IL-1β水平失調(diào)，指出外源性生物胺可能具有影響機(jī)體生理及免疫系統(tǒng)功能的風(fēng)險(xiǎn)。但是當(dāng)外源性生物胺與黃酒共同作用時(shí)，這些情況會(huì)有所變化。當(dāng)黃酒中的生物胺濃度達(dá)到10倍劑量，就可以引起大腦MAO活性升高，當(dāng)黃酒中的生物胺濃度達(dá)到100倍劑量，才出現(xiàn)明顯的IL-1β水平失調(diào)，但肝臟MAO活性無(wú)明顯變化，結(jié)果表明黃酒可能具有對(duì)生物胺保護(hù)作用。限量飲用該黃酒不會(huì)引起大腦、肝臟MAO活性和血液、小腸組織DAO活性的變化和免疫功能失調(diào)，同時(shí)肝臟的病理形態(tài)結(jié)果也輔助證明了其安全性。雖然該黃酒在限量范圍內(nèi)未表現(xiàn)出毒性作用，但生物胺含量的多少會(huì)影響黃酒對(duì)機(jī)體的健康，所以如何降低生物胺含量仍是未來(lái)黃酒發(fā)酵工藝需要克服的一大難點(diǎn)。