水稻白葉枯病菌第二信使c-di-GMP代謝酶基因的預(yù)測和分析

薛丁榕 田芳 李海云 楊鳳環(huán) 陳華民 何晨陽

水稻黃單胞水稻致病變種（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白葉枯病是世界水稻生產(chǎn)上重要的細(xì)菌性病害之一［1］。由于經(jīng)濟(jì)重要性以及遺傳可操作性，水稻-Xoo互作已成為植物-病原物互作研究的模式系統(tǒng)之一［2］。隨著KACC10331（韓國菌株）、MAFF311018（日本菌株）和PXO99A（菲律賓菌株）全基因組測序的完成［3-5］，為深入研究Xoo致病性的信號調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）是一種存在廣泛的細(xì)菌小分子第二信使，調(diào)控了毒性、生物膜形成和運(yùn)動性等諸多生物學(xué)功能［6-8］。含GGDEF結(jié)構(gòu)域的鳥苷酸環(huán)化酶（DGC）和含EAL或HD-GYP 結(jié)構(gòu)域的磷 酸二酯酶（PDE）分別控制了c-di-GMP的合成和降解［9］。GGDEF、EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因在細(xì)菌基因組中廣泛存在，形成一個復(fù)雜的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［10］。

本研究比較分析上述菌株中GGDEF、EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白的種類、數(shù)量及其序列特征，鑒別基序保守的DGC或PDE、基序退化的c-di-GMP信號受體。此外，發(fā)現(xiàn)感知外界環(huán)境信號、調(diào)控輸出結(jié)構(gòu)域活性的信號輸入結(jié)構(gòu)域，旨在為從Xoo中鑒定DGC和PDE編碼基因并研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為PXO99A、MAFF311018和 KACC-10331，其核酸和氨基酸序列來源于NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP000967.1，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_007705.1，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AE013598.1）。

1.2 方法

1.2.1 蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測 利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和 MEME（http：//meme.nbcr.net/meme/tools/meme）程序（參數(shù)設(shè)置motif寬度為最小3，最大50）預(yù)測蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 結(jié)構(gòu)域蛋白基因的分布 運(yùn)用CGView Server作圖，分析結(jié)構(gòu)域蛋白基因在基因組的分布（參數(shù)設(shè)置為 blastx，expect = 0.0 0001，Bacterial and Plant Plastid，filter = yes，alignment_cutoff = 85，identity_cutoff = 85）。

1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［11］， 比 較 所 有 GGDEF、EAL和 HD-GYP結(jié) 構(gòu)域蛋白的相似性；采用基于JTT矩陣基礎(chǔ)模型最大相似法［12］， 構(gòu)建進(jìn)化模型（bootstrap replication=1000）［13］。

1.2.4 基因功能驗(yàn)證 基因功能驗(yàn)證包括DGC/PDE酶活性、c-di-GMP結(jié)合作用以及細(xì)菌毒性相關(guān)表型等測定［14-17］。

2 結(jié)果

2.1 GGDEF、EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白基因的鑒定

PXO99A、MAFF311018和 KACC10331分 別 有26、26 和25個基因編碼了GGDEF、EAL和HDGYP結(jié)構(gòu)域（表1）。PXO99A和MAFF311018基因數(shù)量和類型相同，而KACC10331則比前兩種菌株少一個GGDEF結(jié)構(gòu)域基因（表1和表2）。

鑒定了幾個菌株特異的、只編碼GGDEF結(jié)構(gòu)域基因（表2）。PXO99A獨(dú)有PXO_02615基因，但 缺 少 與 XOO2206（MAFF311018）和 XOO2330（KACC10331）同源的基因；KACC103 31缺少與PXO_04147（PXO99A）和 XOO3786（MAFF311018）同源的基因。

2.2 GGDEF、EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白的同源性分析

GGDEF、EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白基因分散于Xoo整個基因組中，但也存在一定的集聚（圖1）。同源蛋白具有高達(dá)90％以上的序列相似性，同組聚集在一個內(nèi)部節(jié)點(diǎn)上，如單獨(dú)GGDEF結(jié)構(gòu)域聚集在藍(lán)區(qū)，單獨(dú)EAL結(jié)構(gòu)域在綠區(qū)，GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域雜合蛋白在黃區(qū)，HD-GYP結(jié)構(gòu)域在紅區(qū)。所有這些GGDEF和EAL蛋白編碼基因分散在Xoo基因組各部分，但在1800-2 900 kb的位置相對集中（圖2）。結(jié)果表明，3個菌株尤其是MAFF311018菌株和KACC10331菌株在進(jìn)化上的親緣關(guān)系很近。

2.3 DGC和PDE的預(yù)測和功能驗(yàn)證

39％的GGDEF結(jié)構(gòu)域含有GGEEF或GGDEF保守基序（其中GGEEF占62.5％），87％的含有EAL或EVL以及HD-GYP保守基序（表1和表2）。每個菌株有19個GGDEF、EAL和HD-GYP基序保守的蛋白，預(yù)測它們可能是有活性的DGC或PDE；其余退化的蛋白是c-di-GMP信號受體（表2）。

24％的GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白具有DGC酶活性的保守結(jié)構(gòu)，包括保守的GGDEF或GGEEF基序和I位點(diǎn)（RXXD基序）、GTP和Mg2+結(jié)合序列、GTP結(jié)合KXXXR保守序列（圖3）。PDE包含EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白兩種類型。

含EAL結(jié)構(gòu)域的PDE具有對活性非常重要的EAL/E VL和DDFGTG保守基序；RocR的R179和Q161是c-di-GMP結(jié)合關(guān)鍵位點(diǎn)，而D295、N233、E265、E175、E352、E268、K316和 Q372是 Mg2+結(jié)合關(guān)鍵位點(diǎn)［18］，Mg2+為PDE活性所 必須。MEME分析（圖4）表明，Xoo存在 相同的保守位點(diǎn)。含HD-GYP結(jié)構(gòu)域的PDE具有保守的HD和GYP殘基，中間間隔60或61位氨基酸，HD殘基對酶催化的影響非常關(guān)鍵。

表1 水稻白葉枯病菌c-di-GMP相關(guān)基因編碼的結(jié)構(gòu)域

已經(jīng)驗(yàn)證了部分不同結(jié)構(gòu)域蛋白的生物學(xué)功能（表2）。GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域保守的PXO_01019（PdeR）是具有c-di-GMP信號降解活性的PDE［14］；GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域退化的Filp（PXO_0040 3）是c-di-GMP信 號 受 體［15］；EAL單 一 結(jié) 構(gòu) 域 蛋 白PXO_04753（VieAxoo ）突變體生物膜形成明顯增多［16］；HD-GYP 結(jié)構(gòu)域蛋白 PXO_00070（RpfCxoo）突變體毒性、EPS產(chǎn)生、生物膜形成能力等有顯著變化［17］。

2.4 信號輸入結(jié)構(gòu)域的鑒定

信號輸入結(jié)構(gòu)域通過感知外部環(huán)境信號變化，調(diào)節(jié)下游輸出結(jié)構(gòu)域的活性。GGDEF、EAL和HDGYP蛋白具有多種信號接受結(jié)構(gòu)域（表1）。19％的DGC和40％的PDE具有REC結(jié)構(gòu)域，接收磷酸化信號［19］。24％的DGC和27％的PDE具有PAS結(jié)構(gòu)域，能感應(yīng)環(huán)境氧、光、氧化還原電位、小配基以及細(xì)胞總能級的變化［20］。10％的DGC和13％的PDE包含GAF結(jié)構(gòu)域，與cGMP結(jié)合后能調(diào)節(jié)催化活性［21］。HAMP僅存在于GGDEF蛋白中，與配基結(jié)合后具有調(diào)節(jié)同源二聚體受體磷酸化和甲基化的作用［22］。3個同源蛋白（PXO_02019、XOO1324和 XOO1440）具有Cache_1結(jié)構(gòu)域，參與細(xì)菌趨化性的小分子識別［23］。3個 同 源 蛋 白（PXO_01741、XOO1775和XOO1879）具有CHASE3結(jié)構(gòu)域，涉及跨膜受體的信號接收［24］。

此外，11％的DGC和7％的PDE具有信號肽，48％的DGC和33％的PDE具有跨膜結(jié)構(gòu)（表1），表明這些信號肽可以透過或者錨定在細(xì)胞膜上，發(fā)生 DGC 和 PDE 活性的調(diào)節(jié)［25，26］。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)在Xoo中存在大量的c-di-GMP信號相關(guān)的基因，反映了其在細(xì)菌中具有重要的作用。其中一部分基因編碼了DGC和PDE代謝酶，控制了c-di-GMP的胞內(nèi)含量，另一部分結(jié)構(gòu)域發(fā)生退化，可能編碼了受體或結(jié)合蛋白，與c-di-GMP信號分子結(jié)合后，進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌包括毒性、生物膜形成、EPS產(chǎn)生和運(yùn)動性等在內(nèi)的諸多生物學(xué)功能。然而，c-di-GMP信號途徑是一個非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可能存在反饋抑制c-di-GMP合成的調(diào)節(jié)作用。此外，它還與雙組份系統(tǒng)、群體感應(yīng)信號系統(tǒng)等共同發(fā)揮作用，介導(dǎo)了下游的調(diào)控反應(yīng)。

表2 水稻白葉枯病菌GGDEF、EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域的保守和變異的基序

在其它一些與Xoo近緣關(guān)系相近的黃單胞細(xì)菌中，c-di-GMP信號基因的功能已獲得了驗(yàn) 證。橘黃單胞菌（X. citri subsp. citri）XAC0610（PXO_04155、XOO_3792和XOO_4021同源蛋白）具有DGC酶活性，雖然它并不具有GGDEF/GGEEF保守基序，但具有與Mg2+和GTP結(jié)合的保守位點(diǎn)［27］。水稻細(xì)菌性條斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola）RpfG（PXO_00070、XOO_2236和XOO_2871的同源蛋白）和野油菜黃 單 胞 菌（X. campestris）RavR具 有 PDE酶 活性［28，29］。磷酸化后的RavR雜合結(jié)構(gòu)域蛋白具有PDE活性，去磷酸化后具有DGC酶活性［30］，這更加說明c-di-GMP代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。

另外，雖然已驗(yàn)證Xoo四個GGDEF、EAL和HD-GYP 結(jié)構(gòu)域蛋白的功能，但其它大多數(shù)的功能尚有待試驗(yàn)分析。目前，正在對其余蛋白進(jìn)行DGC/PDE活性、c-di-GMP結(jié)合作用以及細(xì)菌毒性相關(guān)表型等測定。

圖1 采用最大似然法構(gòu)建水稻白葉枯病菌系統(tǒng)進(jìn)化樹

4 結(jié)論

Xoo GGDEF、EAL和HD-GYP 結(jié)構(gòu)域蛋白參與了c-di-GMP信號途徑，包括作為DGC或PDE合成或降解了c-di-GMP，或作為c-di-GMP信號受體調(diào)控了細(xì)菌生物學(xué)功能。此外，多數(shù)蛋白具有感知環(huán)境信號變化的輸入結(jié)構(gòu)域，調(diào)控輸出結(jié)構(gòu)域的活性。

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圖2 水稻白葉枯病菌c-di-GMP代謝相關(guān)基因在基因組的分布

圖3 MEME分析水稻白葉枯病菌DGC的保守序列

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圖4 MEME分析水稻白葉枯病菌PDE的保守序列

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