一株具有抗菌活性芽孢桿菌HN-7的分離及抗菌活性研究

黃承敏，王蓉蓉，肖 茜，劉成國(guó)，周 輝*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是生物機(jī)體在抵御病原微生物的防御反應(yīng)中所產(chǎn)生的一類抗微生物與一些惡性細(xì)胞的短肽。抗菌肽具有分子質(zhì)量小、水溶性好、耐熱性強(qiáng)、無(wú)免疫原性、抗菌譜廣等特點(diǎn)，在食品加工過(guò)程中不易受到破壞，同時(shí)它又可生物降解生物吸收，因而安全性較高。因此，抗菌肽是一種天然安全的食品防腐劑[1]。芽孢桿菌屬（Bacillussp.）是繼乳酸菌后產(chǎn)抗菌肽研究比較普遍的一類細(xì)菌屬。目前，對(duì)于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）等產(chǎn)抗菌肽的研究在國(guó)內(nèi)外已有很多報(bào)道。其中，蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）產(chǎn)生的抗菌肽有cerein 7B[2]、cerein 8A[3-5]、cerein MRX1[6]及—cerein 7[7]等。其中，cerein 7對(duì)牛鏈球菌（Streptococcus bovis）、鳥鏈球菌（Streptococcusavium）、耐萬(wàn)古霉素（vancomycin-resistant）、馬鏈球菌（Streptococcus equines）、耐萬(wàn)古霉素替考拉寧耐藥（vancomycin-resistant teicoplanin-resistant）、黃褐色微球菌（Micrococcus luteu）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、酪酸梭狀芽胞桿菌（Clostridium butyricum）等革蘭氏陽(yáng)性菌都有很好的抑菌效果[8-10]；cerein 8A對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）ATCC 7644、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922和腸炎沙門菌（Salmonella enteritidis）ATCC13076 有很好的抑制作用[11-12]；cerein MRX1對(duì)表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）JCM 2414、牛鏈球菌（S.bovis）JCM5802、無(wú)毒李斯特菌（L.innocua）ATCC 3309、多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）CCM 1459等菌均有良好的抑制效果[13-15]。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes）簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對(duì)人類的安全具有危險(xiǎn)，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中，必須加以重視。

基于此，本研究以單增李斯特氏菌（L.monocytogenes）54002為指示菌，從發(fā)酵豆制品中分離得到能夠抑制單增李斯特氏菌生長(zhǎng)的目標(biāo)菌株，并確定其抑菌物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)及生物活性，旨在尋找抑菌范圍廣、性能穩(wěn)定且無(wú)毒害的抗菌肽，為開發(fā)新型抗菌肽及其在實(shí)際中的應(yīng)用鑒定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與樣品

指示菌單增李斯特菌（L.monocytogenes）54002，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、類干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（E.coli）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）：由本實(shí)驗(yàn)室保存。湖南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉樣品：市售。

1.1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基（初始發(fā)酵培養(yǎng)基）、指示菌培養(yǎng)基為腦心浸液（brian heart infusion，BHI）液體培養(yǎng)基、BHI固體培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 化學(xué)試劑

胃蛋白酶（酶活1200U/g）、胰蛋白酶（酶活50000U/g）、NaOH、HCl（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9272BS-Ⅲ生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；LDZX-50 FBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；UV-1200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：翱藝儀器（上海）有限公司；TGL-20M離心機(jī)：長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；雷磁pHs-3C pH計(jì)：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的篩選

單核增生李斯特菌菌液制備：將活化過(guò)夜的單增李斯特菌按1%接種至50 mLBHI液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)至穩(wěn)定期，備用。

產(chǎn)抗菌肽芽孢桿菌的初篩：取豆豉樣品約25.00g，加入225 mL的無(wú)菌生理鹽水中，充分振蕩后在80℃的水浴中保溫30 min，殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，然后制備系列稀釋溶液，選取合適稀釋度的稀釋液，移取0.1 mL涂布于BHI固體平板中，培養(yǎng)過(guò)夜。將單增李斯特菌菌液0.1 mL與100 mL溶化后并保持50℃左右的BHI半固體培養(yǎng)基進(jìn)行混合，混勻后輕輕倒在長(zhǎng)有芽孢桿菌菌落的BHI固體培養(yǎng)基上層，待培養(yǎng)基凝固后將平板繼續(xù)培養(yǎng)20 h，選取有抑菌圈的菌株，進(jìn)行菌落的挑取，在BHI培養(yǎng)基平板上劃線純化、斜面保存。

1.3.2 復(fù)篩

參考O'CONNOR E B等[16]的方法：將單核增生李斯特菌菌液0.1 mL與100 mL溶化后并保持在50℃左右的BHI固體培養(yǎng)基進(jìn)行混合，傾注平板，待培養(yǎng)基凝固后輕輕放置無(wú)菌牛津杯（內(nèi)徑0.6 cm，外徑0.8 cm，高1.0 cm），在牛津杯中加入0.2 mL初篩菌的發(fā)酵上清液，4℃冰箱中擴(kuò)散4 h以上，37℃培養(yǎng)12 h，觀察抑菌圈大小，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.3 酶敏感性實(shí)驗(yàn)

將篩選菌株HN-7發(fā)酵上清液分裝到2個(gè)10 mL Eppendorf管中，每管2.0 mL，調(diào)至各酶作用的最適pH值（胃蛋白酶最適pH值為2.0、胰蛋白酶最適pH值為8.0），分別在不同的管中加入胰蛋白酶、胃蛋白酶，使其終質(zhì)量濃度為1mg/mL，37℃處理2 h，再調(diào)pH至7.0，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，對(duì)照為未經(jīng)酶處理的pH7.0的菌株HN-7發(fā)酵上清液，比較抑菌圈差異。

1.3.4 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將菌株HN-7發(fā)酵上清液pH調(diào)至7.0，分裝到8個(gè)1.5 mL Eppendorf管中，每管1.0mL，分別做如下處理：100℃、10min，100℃、30min，100℃、90min，121℃、10min，121℃、20min，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，對(duì)照為未作熱處理的pH 7.0的菌株HN-7發(fā)酵上清液，比較抑菌圈差異。

1.3.5 酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將菌株HN-7發(fā)酵上清液分裝到6個(gè)10 mL Eppendorf管中，每管2.0 mL，用1.2 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液，分別調(diào)pH至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，37 ℃處理2 h，再調(diào)pH至7.0，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，對(duì)照為未作酸堿處理的pH 7.0的菌株HN-7發(fā)酵上清液，比較抑菌圈差異。

1.3.6 紫外線穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將菌株HN-7發(fā)酵上清液，調(diào)pH至7.0，分別在20 W紫外燈照射（照射距離10 cm）0.5～2.0 h，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，對(duì)照為未作紫外處理的pH 7.0的菌株HN-7發(fā)酵上清液，比較抑菌圈差異。

1.3.7 抗菌肽產(chǎn)量與細(xì)菌生長(zhǎng)關(guān)系

在500 mL BHI液體培養(yǎng)基中以1%的接種量接入菌株HN-7在37℃培養(yǎng)。每隔3 h取發(fā)酵液，測(cè)定其在波長(zhǎng)600 nm處的OD600nm值，并測(cè)定發(fā)酵液中抑菌圈直徑。通過(guò)發(fā)酵液中抑菌圈直徑的變化反映抗菌肽產(chǎn)量的變化。

1.3.8 抑菌譜

將菌株HN-7發(fā)酵上清液pH調(diào)至7.0，對(duì)金黃色葡萄球菌（G+）、大腸桿菌（G-）、藤黃微球菌（G+）、枯草芽孢桿菌（G+）、單增李斯特氏菌（G+）等指示菌做抑菌實(shí)驗(yàn)，確定抑菌譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)抗菌肽芽孢桿菌的篩選

利用瓊脂擴(kuò)散方法，從樣品中篩選出一株抑菌效果明顯（抑菌圈直徑＞牛津杯外徑0.8 cm）的芽孢桿菌（Bacillus sp.），命名為菌株HN-7。

2.2 酶敏感性實(shí)驗(yàn)

將菌株HN-7的發(fā)酵上清液用胰蛋白酶和胃蛋白酶處理后，調(diào)節(jié)pH至7.0后，做抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌株HN-7抗菌肽對(duì)酶的敏感性Table 1 Sensitivity of the antibacterial peptides of strain HN-7 to enzymes

由表1可知，未處理的發(fā)酵上清液抑菌效果明顯，用胰蛋白酶、胃蛋白酶處理后抑菌活性沒(méi)消失。胰蛋白酶、胃蛋白酶同屬于消化性蛋白酶，能將蛋白質(zhì)分解成小分子氨基酸，菌株HN-7的發(fā)酵上清液在其處理后抑菌圈直徑減少，說(shuō)明此發(fā)酵上清液中含有多肽，在胰蛋白酶、胃蛋白酶的作用下分解為氨基酸，結(jié)構(gòu)的變化影響了抑菌活性，而胰蛋白酶抑菌圈直徑小于胃蛋白酶抑菌圈直徑，說(shuō)明該上清液對(duì)胰蛋白酶更加敏感。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)發(fā)酵上清液中存在的抑菌物質(zhì)是脂肽。

2.3 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將菌株HN-7的發(fā)酵上清液pH調(diào)至7.0后，用不同的溫度處理不同的時(shí)間后做抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 菌株HN-7抗菌肽的熱穩(wěn)定性Fig.1 Thermos stability of the antibacterial peptides of strain HN-7

由圖1可知，菌株HN-7抗菌肽經(jīng)121℃處理20 min仍具有很強(qiáng)的抑菌活性，抑菌圈直徑為1.7 mm，與對(duì)照相比僅相差0.1 mm。說(shuō)明芽孢桿菌HN-7產(chǎn)高熱穩(wěn)定性抗菌肽，這對(duì)于今后的工業(yè)化生產(chǎn)和食品加工應(yīng)用將有重要意義。

2.4 酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取菌株HN-7的發(fā)酵上清液，用不同的酸堿度處理2 h后，調(diào)pH值至7.0，做抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 菌株HN-7抗菌肽的酸堿穩(wěn)定性Fig.2 pH stability of the antibacterial peptides of strain HN-7

由圖2可知，菌株HN-7抗菌肽在pH從2～12的范圍內(nèi)抑菌效果較為穩(wěn)定，在1.5～1.7 cm之間，與對(duì)照相比抑菌圈直徑僅降低0.1～0.3 cm，表明這種抗菌肽具有較好的酸堿穩(wěn)定性。

大部分抗菌肽都是在酸性條件下穩(wěn)定，有的抗菌肽在中性或堿性條件下即會(huì)失活。如應(yīng)用廣泛的Nisin，在pH≤2.0的稀鹽酸中有高活性，但在pH 5.0時(shí)失活40%，pH 6.8時(shí)將喪失90%的活力[1]。而菌株HN-7抗菌肽，在酸性中性甚至堿性條件下都有活力，且抑菌活性較高，可滿足不同食品基質(zhì)的酸堿要求，拓寬了它的應(yīng)用范圍。

2.5 紫外線穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

菌株HN-7對(duì)紫外線照射的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，紫外線對(duì)菌株HN-7發(fā)酵上清液照射0.5～2.0 h，抗菌活性和未經(jīng)紫外線處理的無(wú)明顯差別，與對(duì)照相比紫外線處理0.5 h抗菌活性沒(méi)有變化，紫外線照射處理2.0 h抗菌直徑僅降低0.1cm，說(shuō)明紫外對(duì)芽孢桿菌HN-7所產(chǎn)抗菌肽的抗菌活性沒(méi)有影響。

表2 菌株HN-7抗菌肽對(duì)紫外線的穩(wěn)定性Table 2 Ultraviolet stability of the antibacterial peptides of strain HN-7

2.6 抗菌肽產(chǎn)量與細(xì)菌生長(zhǎng)關(guān)系

為了研究抗菌肽產(chǎn)量變化與細(xì)菌生長(zhǎng)的關(guān)系，連續(xù)24h測(cè)定菌株HN-7菌的OD600nm值和其發(fā)酵液的抑菌圈直徑，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株HN-7的發(fā)酵液中抑菌圈變化趨勢(shì)與細(xì)菌的OD600nm值變化基本相同。芽孢桿菌HN-7從3～12 h呈現(xiàn)直線增長(zhǎng)，12～18 h緩慢生長(zhǎng)，逐步達(dá)到穩(wěn)定期，并在18 h抑菌圈達(dá)到最大值1.9 cm，18 h后菌株逐漸進(jìn)入衰亡期，抑菌圈與OD600nm值都呈下降趨勢(shì)，因此可以確定菌株HN-7抗菌肽最佳收獲期為18 h。

圖3 菌株HN-7抗菌肽產(chǎn)量和菌株HN-7生物量的關(guān)系Fig.3 Relation of production of antibiotic lipopeptide and biomass of strain HN-7

2.7 抑菌譜的測(cè)定

表3 菌株HN-7抗菌肽的抑菌譜Table 3 Antimicrobial spectrum of antibacterial peptides of strain HN-7

由表3可知，菌株HN-7抗菌肽對(duì)植物乳桿菌、類干酪乳桿菌等乳酸菌沒(méi)有抑制作用，而對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特氏菌都有的抑制效果，尤其是單增李斯特氏菌。如果抗菌肽作為一種食品防腐劑應(yīng)用到食品中，在抑制腐敗及病原微生物的同時(shí)，而又不對(duì)食品中的有益菌不產(chǎn)生抑制作用，不僅可以提高抗菌肽的作用效率，同時(shí)又能保證食品的品質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究從湖南傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中，篩選出一株具有強(qiáng)抑菌能力的芽孢桿菌（Bacillussp.），經(jīng)過(guò)蛋白酶酶解結(jié)合酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性等試驗(yàn)，初步推斷該菌能產(chǎn)生抗菌肽。菌株HN-7所產(chǎn)抗菌肽在18 h的抑菌圈達(dá)到最大值（1.90 cm），pH 2.0～12.0、121℃處理20 min條件下仍有抑菌活性。該抗菌肽具有較廣的抑菌譜，不僅能抑制單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌，還能抑制大腸桿菌等革蘭氏陰性菌。較廣的抑菌譜與良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性對(duì)于這種抗菌肽在食品加工中的應(yīng)用具有重要意義。