基于Miseq高通量測序技術(shù)的古襄陽酒窖泥細菌多樣性評價

楊小麗，尚雪嬌，余海忠，劉文匯，楊少勇，郭 壯*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.湖北古襄陽酒業(yè)有限公司，湖北 襄陽 441100）

作為我國銷量最大的白酒類型，濃香型白酒是以糧谷為主要原料，經(jīng)傳統(tǒng)固態(tài)法發(fā)酵、蒸餾、陳釀和勾兌而成[1]。濃香型白酒的發(fā)酵主要在窖池中完成，窖泥微生物區(qū)系的形成和演變很大程度上決定了產(chǎn)品的質(zhì)量[2]，因而對窖泥中微生物的群落結(jié)構(gòu)進行解析則顯得尤為重要。目前國內(nèi)學(xué)者常采用傳統(tǒng)微生物學(xué)手段[3-5]和以變性梯度凝膠電泳技術(shù)（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）為代表的指紋圖譜技術(shù)[6-8]揭示窖泥中微生物的多樣性。然而傳統(tǒng)微生物學(xué)手段依賴于純培養(yǎng)技術(shù)，對于多數(shù)營養(yǎng)要求苛刻、嚴(yán)格厭氧的微生物分離較為困難，難以獲取微生物群落更為完整全面的信息[9]。雖然指紋圖譜技術(shù)具有無需培養(yǎng)的技術(shù)優(yōu)勢，但仍存在無法實現(xiàn)樣品間平行分析和圖譜條帶信息量低的缺陷[10]。

以Illumina MiSeq為代表的第二代高通量測序技術(shù)具有通量高、準(zhǔn)確率高和試驗周期短的特點，可在分類學(xué)地位“屬”水平上全面客觀地揭示目標(biāo)環(huán)境中微生物群落信息[11]。LIU M等[12]分別采用DGGE和MiSeq技術(shù)對瀘州老窖5年與100年窖泥中的真菌微生物進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DGGE僅檢測到了12個菌屬，而Miseq技術(shù)可以檢測到111個菌屬。湖北省是國內(nèi)白酒生產(chǎn)與消費的重要省份，2016年白酒產(chǎn)量逾90萬kL，銷售收入近800億元，白酒生產(chǎn)企業(yè)近450家[13]。作為省域副中心城市的襄陽市亦提出了力爭襄陽白酒產(chǎn)業(yè)過百億元，打造鄂酒除稻花香和白云邊之外的湖北白酒“第三極”的行業(yè)發(fā)展目標(biāo)。但是目前關(guān)于襄陽地區(qū)濃香型白酒窖泥微生物多樣性評價的報道尚少。

本研究采用Miseq高通量測序技術(shù)，對4份采集自湖北古襄陽酒業(yè)窖泥的細菌多樣性進行了解析，同時結(jié)合傳統(tǒng)微生物學(xué)手段對其中蘊含的乳酸菌菌株進行了分離鑒定，通過本項目的實施以期為華中地區(qū)濃香型白酒窖泥微生物的多樣性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖泥：采集自湖北古襄陽酒業(yè)窖泥車間；E.Z.N.A.RSoil DNA Kit試劑盒：美國OMEGA公司；10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液和DNA聚合酶：寶生物工程（大連）有限公司；FastPfuFly脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA） 聚合酶、5×Trans StartTMFastPfu Buffer和三磷酸脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTPs）Mix：北京全式金生物技術(shù)有限公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；十六烷基三甲基溴化銨、異戊醇、乙醇、氯仿、乙二胺四乙酸二鈉、碳酸鈣、三羥甲基氨基甲烷、飽和酚、十二烷基硫酸鈉和醋酸鈉：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；引物338F/806R（其中正向引物前端加入7個核苷酸標(biāo)簽）和引物27F/1495R：由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；vetiri梯度基因擴增儀：美國AB公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；FluorChem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國Fluor Chem公司；Miseq高通量測序平臺：美國Illumina公司；DG250厭氧工作站：英國DWS公司；ECLIPSE Ci生物顯微鏡：日本Nikon公司；R920機架式服務(wù)器：美國DELL公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集及DNA提取

從湖北古襄陽酒業(yè)有限公司窖泥車間的4個窖齡為2年的窖池中分上中下3個部位進行樣品采集，4個窖池同時建造且深度均為2.2 m，取樣時從每個窖壁的上層（距地面20 cm）、中層（距地面110 cm）和窖底3個位置各取100 g窖泥。將同一窖池來源的窖泥混合均勻后裝入無菌采樣袋中低溫運送回實驗室，編號分別為GXY1、GXY2、GXY3和GXY4。采用E.Z.N.A.RSoilDNAKit試劑盒對窖泥中微生物宏基因組DNA進行提取。

1.3.2 細菌16S rDNA序列V4-V5區(qū)擴增及高通量測序

擴增體系為：DNA模板10 ng，5 μmol/L正向和反向引物各0.8 μL，5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL，2.5 mmol/L dNTPs mix2μL，10×PCR緩沖液4μL，體系用ddH2O補充至20μL。擴增條件為：95℃、3 min，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72、℃ 45 s，35個循環(huán)，72℃、10 min。PCR產(chǎn)物檢測合格后，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Miseq PE300平臺進行高通量測序。

1.3.3 序列質(zhì)控

將雙端序列進行拼接后，根據(jù)核苷酸標(biāo)簽（barcode）信息將拼接好的序列劃分到各樣品，同時去除各條序列中的barcode和引物。在拼接過程中序列需滿足以下條件[14]：

1）重疊區(qū)≥10 bp；

2）最大錯配比率≤0.2；

3）7個barcode堿基不存在錯配；

4）引物堿基錯配數(shù)≤2 bp。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

使用QIIME（v1.7.0）分析平臺[15]按照以下流程進行生物信息學(xué)分析：

1）使用PyNAST[16]將序列對齊；

2）采用UCLUST算法[17]，根據(jù)100%和97%的相似性將對齊后的序列進行歸并，并建立分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）；

3）使用ChimeraSlayer軟件[18]進行嵌合體檢查，去除含有嵌合體的OTU，同時定義存在所有4個窖泥樣品中的OTU為核心OTU；

4）從去除嵌合體的OTU中選取代表性序列，使用RDP（Ribosomal Database Project，Release 11.5）[19]和Greengenes（Release 13.8）[20]數(shù)據(jù)庫在門、綱、目、科和屬水平明確其分類學(xué)地位，同時計算該OTU在各樣品中的相對含量。若隸屬于某一門、屬或OTU的樣品在所有樣品中的平均相對含量＞1.0%，則將其定義為優(yōu)勢門、屬或優(yōu)勢OTU，若某一OTU在所有樣品中均存在則將其定義為核心OTU。

5）進一步從去除嵌合體的OTU中選取代表性序列，使用FastTree軟件[21]繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并對香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）和超1指數(shù)（Chao1 index）等α多樣性指數(shù)進行計算。

1.3.5 核酸登錄號

Miseq高通量測序數(shù)據(jù)提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫（http：//metagenomics.anl.gov/），ID號為mgp83537。

1.3.6 乳酸菌的分離鑒定

采用10倍梯度將窖泥樣品倍比稀釋后，分別涂布于含有CaCO3的MRS瓊脂培養(yǎng)基平板中，于厭氧條件下（85%N2，5%CO2及10%H2）37℃培養(yǎng)48 h后挑取有透明圈的且形態(tài)不同的菌落進行分離純化，30%甘油-80℃保藏備用。參照武俊瑞等[22]的方法使用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取疑似乳酸菌分離株的基因組DNA并進行16SrDNA序列擴增，檢測合格的PCR產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司進行序列測定。反饋回的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行基本局部相似性比對搜索工具（BLAST）同源性比對分析，繼而構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進而明確乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

使用Mega5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹；使用在線軟件Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制維恩（Venn）圖；其他圖均使用Origin 8.6軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

本研究采集的4個濃香型窖泥樣品共產(chǎn)出140 750條高質(zhì)量16S rDNA序列，平均每個樣品產(chǎn)出35 188條。去除引物和barcode后的序列長度分布圖如圖1所示。

圖1 序列長度分布圖Fig.1 Distribution diagram of sequence length

由圖1可知，去除引物和barcode后，測序序列長度主要集中在440～459 bp，占到序列總數(shù)的84.92%，另有13.98%的序列長度集中在420～439bp。使用PyNAST將序列對齊，共有1466條序列因比對失敗而被剔除，因而共有139284條序列進行OTU劃分。4個窖泥樣品16S rDNA V4-V5區(qū)序列測序情況及各分類地位數(shù)量如表1所示。

表1 樣品16S rDNA測序情況及各分類地位數(shù)量Table 1 16S rDNA sequencing and number of taxonomical status ofsamples

由表1可知，根據(jù)100%的相似性進行UCLUST時共得到了139284條代表性序列，繼而根據(jù)97%相似性劃分得到了4 772個OTU，采用ChimeraSlayer檢測到965個OTU存在嵌合體，去除嵌合體后還剩余3 807個OTU，每個樣品平均1 476個。在OTU劃分的基礎(chǔ)上，本研究將序列鑒定為21個門、59個綱、96個目、199個科和425個屬，其中僅有0.24%和6.14%的序列不能鑒定到門和屬水平。由表1亦可知，在4個窖泥樣品中GXY3的Chao 1指數(shù)最高而GXY1的Shannon指數(shù)最大，由此可見，GXY3窖池中細菌微生物的豐富度最大而GXY1窖泥細菌多樣性最高。

2.2 基于各分類學(xué)地位窖泥細菌相對含量的分析

2.2.1 主要細菌在門水平上的相對含量分析

古襄陽濃香型白酒窖泥樣品中平均相對含量＞1.0%的細菌門如圖2所示。

由圖2可知，在門水平上，窖泥中的細菌類群主要隸屬于硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其平均相對含量分別為92.02%、2.92%、1.83%和1.28%。

圖2 窖泥中優(yōu)勢細菌門相對含量的比較分析Fig.2 Comparative analysis on the content of the dominant bacteria in pit mud samples in phyla level

2.2.2 主要細菌在屬水平上的相對含量分析

古襄陽濃香型白酒窖泥樣品中平均相對含量＞1.0%的細菌屬如圖3所示。

圖3 窖泥中優(yōu)勢細菌屬相對含量的比較分析Fig.3 Comparative analysis on the content of the dominant bacteria in pit mud samples in genus level

由圖3可知，窖泥中細菌主要隸屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、梭菌屬（Clostridium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和高溫放線菌屬（Thermoactinomyces），其平均相對含量分別為77.16%、3.70%、1.64%和1.04%。由此可見，窖泥中細菌類群主要由隸屬于硬壁菌門（Firmicutes）的4個屬構(gòu)成，累計相對含量為83.53%。

2.2.3 基于OTU水平的Venn圖分析

本研究進一步在OTU水平對窖泥中細菌菌群的構(gòu)成進行了解析，基于OTU水平的Venn圖如圖4所示。

由圖4可知，通過兩步UCLUST劃分，本研究共得到3 807個OTU，雖然核心OTU有241個，僅占OTU總數(shù)的6.33%，但其包含了118 950條序列，占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的87.25%。此外，在4個樣品中分別出現(xiàn)3次、2次和1次的OTU分別有420個、532個和2 614個，分別占OTU總數(shù)的11.03%、13.97%和68.66%，其包含的序列數(shù)分別為11839條、2071條和3468條，分別占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的8.68%、1.52%和2.54%。由此可見，雖然有些濃香型窖池較之其他窖池可能含有一些較為獨特的細菌種系型，但其平均含量僅為0.001%。

圖4 基于OTU水平的Venn圖Fig.4 Venn diagram based on OTU level

2.2.4 核心OTU相對含量熱圖及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

本研究進一步繪制了相對含量＞1.0%的核心OTU在各窖泥樣品中相對含量的熱圖，并依據(jù)各OUT的相對含量建立了左側(cè)和上方的聚類樹，結(jié)果如圖5所示。

圖5 相對含量大于1.0%的核心OTU在各窖泥樣品中相對含量的熱圖Fig.5 Heat map of core OTU in pit mud samples with the relative abundance more than 1.0%

由圖5可知，在241個核心OTU中，平均相對含量＞1.0%的OTU有8個，其中7個隸屬于Lactobacillus，1個隸屬于Thermoactinomycetaceae。8個OTU的累計平均相對含量為71.31%，其中均隸屬于Lactobacillus的OTU662和OTU792的平均相對含量為35.01%和16.99%。進一步選取上述8個核心OTU中的代表性序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，其結(jié)果如圖6所示。

圖6 相對含量大于1.0%OTU的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of OTU with relative abundance more than 1.0%

由圖6可知，OTU792、OTU662、OTU4536、OTU2192、OTU2891、OTU2828和OTU2357中的代表性序列可以與耐酸乳桿菌（Lactobacillusacetotolerans）形成聚類，而OTU4559雖然可被鑒定到Thermoactinomycetaceae，但無法將其與某一種細菌形成聚類。

2.3 窖泥中乳酸菌的分離及鑒定

本研究從4個濃香型白酒窖泥樣品中共分離了12株菌株，所有菌株在含有1%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基中均可形成透明圈，革蘭氏染色均為陽性，過氧化氫酶試驗均為陰性，初步鑒定該12株菌為乳酸菌。將12株菌進行16S rDNA擴增產(chǎn)物測序后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中將序列結(jié)果進行了相似性比對，并構(gòu)建了乳酸菌菌株和參考菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖7所示。

圖7 乳酸菌菌株和參考菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria and reference strains

由圖7可知，12株菌與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）NBRC15889和副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillusparacaseisubsp.paracasei）JCM8130形成了一個類群，且所有乳酸菌與對應(yīng)的參考菌株同源性均達到了99%以上。由此可見，本研究分離出的乳酸菌均隸屬于L.paracasei，但僅采用16S rDNA序列同源性比對無法明確其“亞種”分類學(xué)地位。

3 結(jié)論

本研究采用Miseq高通量測序技術(shù)，對4份采集自湖北古襄陽酒業(yè)窖泥的細菌多樣性進行了解析，結(jié)果顯示窖泥中細菌主要由隸屬于Firmicutes的Lactobacillus、Clostridium、Bacillus和Thermoactinomyces構(gòu)成，經(jīng)分離鑒定發(fā)現(xiàn)其中的乳酸菌均為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）。