沉香的化學(xué)成分及鑒偽技術(shù)研究進展

陳虹霞, 康秀棠, 尤龍杰, 王成章,3*

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)局 林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室；江蘇省 生物質(zhì)能源與材料重點實驗室， 江蘇 南京 210042； 2.福建省香產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心， 福建 泉州 362600； 3.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所， 北京 100091)

沉香(AquilariaeresinatumLignum)為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬植物沉香和白木香含有黑色樹脂的木材，是傳統(tǒng)的名貴中藥材和天然香料，主要分布在中國、日本、印度、中東、東南亞等國家[1]。目前發(fā)現(xiàn)的瑞香科中有19種沉香屬樹種，但能產(chǎn)沉香的只有4種，分別為馬來西亞沉香(Aquilariamalaccensis)、奇楠沉香(Aquilariacrassna)、土沉香(Aquilariasinensis)和菲律賓沉香(Aquilariafilaria)[2-3]。沉香作為傳統(tǒng)中藥在我國使用悠久，臨床上主要用于治療肺心病、冠心病、腦溢血、胃寒和哮喘等疾病[4-6]。沉香除了藥用價值，還具有很高的收藏價值。近年來，由于受到自然災(zāi)害和人為濫采濫伐的影響，沉香資源越來越匱乏，導(dǎo)致沉香價格節(jié)節(jié)攀升，同時劣質(zhì)沉香和摻假沉香充斥市場，嚴(yán)重?fù)p害了消費者的利益。因此，筆者針對沉香行業(yè)目前的現(xiàn)狀，對國內(nèi)外沉香的化學(xué)成分、檢測方法和鑒偽技術(shù)的研究進展進行綜述，比較現(xiàn)階段沉香鑒偽技術(shù)的特征和適用性，以期為沉香產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和行業(yè)發(fā)展提供借鑒依據(jù)。

1 沉香化學(xué)成分

根據(jù)國內(nèi)外的報道，沉香的化學(xué)成分主要包括揮發(fā)油、 2-(2-苯乙基)色酮類和三萜類等。

1.1 揮發(fā)油

揮發(fā)油中主要是倍半萜類化合物以及少量簡單的揮發(fā)性化合物和脂肪酸類化合物。目前發(fā)現(xiàn)的倍半萜化合物共有70多種，根據(jù)其骨架類型，可分為呋喃型、螺旋烷型、桉烷型、愈創(chuàng)木烷型、杜松烷型、艾里莫酚烷型和前香草烷型等[7-9]，各類型典型化合物的結(jié)構(gòu)如圖1所示。揮發(fā)性化合物主要為芳香族化合物，如萘、呋喃甲醛、香豆酮、二氫香豆素、 2-苯乙基-苯、 4-苯基-2-丁酮和芐基丙酮等[3]。脂肪酸類成分主要包括棕櫚酸、硬脂酸、十八碳-9-烯酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、油酸、亞油酸和十八碳三烯酸等[10-12]。

不同品種沉香揮發(fā)油主要成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，馬來西亞沉香揮發(fā)油中主要成分為芳香族，含有32.1%的4-苯基-2-丁酮，6.5%的沉香艾里莫醇和5.8%的沉香愈創(chuàng)木烯[13]；奇楠沉香揮發(fā)油主要成分為倍半萜類化合物，其中白木香醛和α-愈創(chuàng)烯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為36.31%和14.12%，其次是艾里莫芬-7(11),9-二烯-8-酮(4.66%)、檀香醇(3.80%)、α-沉香呋喃(3.18%)、α-古云烯(2.17%)、α-蛇麻烯(2.02%)、蒼術(shù)醇(2.01%)和沉香螺旋醇(1.73%)[14]；土沉香揮發(fā)油主要成分為倍半萜類化合物和芳香族類化合物，其中芐基丙酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為19.51%，其次為α-古巴烯-11-醇(6.24%)、環(huán)氧化紅沒藥烯(4.68%)、馬兜鈴?fù)?4.06%)、蛇床烯(3.49%)、石竹烯氧化物(3.39%)和蓽澄茄油烯醇(3.30%)[15]。

圖1 沉香中倍半萜骨架典型結(jié)構(gòu)Fig. 1 Typical structures of sesquiterpenes from agarwood

1.2 2-(2-苯乙基)色酮類

2-(2-苯乙基)色酮類化合物是沉香中除了倍半萜類化合物之外的另一種標(biāo)志性化合物，目前從沉香中分離鑒定的色酮類化合物有80多種，包括沉香四醇、異沉香四醇、 2-(2-苯乙基)色酮和2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮等類型[16-17]，如圖2所示。奇楠沉香中主要含有2-(2-苯乙基)色酮和2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮，不同色澤、不同產(chǎn)地的奇楠沉香的色酮類含量差異較大，通過GC-MS分析了5種奇楠沉香樣品的乙醚提取物，其中海南白奇、海南紫奇、海南綠奇、越南綠奇和海南黃奇乙醚提取物中2種色酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和分別為66.47%、 82.09%、 84.71%、 71.98%和16.09%[18-19]。Yagura等[20]從土沉香中分離鑒定了4種色酮類化合物，分別為5-羥基- 6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、 6-羥基-2-(2-羥基-2-苯乙基)色酮、 6,7-二羥基-2-(2-苯乙基)-5,6,7,8-四氫色酮和8-氯-2-(2-苯乙基)-5,6,7-三羥基-5,6,7,8-四氫色酮。Wu等[21]從馬來西亞沉香中分離鑒定了6-甲氧基-2-(4′-甲氧基-2-苯乙基)色酮、 8-氯-2-(4′-甲氧基-2-苯乙基)-5,6,7-三羥基-5,6,7,8-四氫色酮、 8-氯-2-(3′-羥基- 4′-甲氧基-2-苯乙基)-5,6,7-三羥基-5,6,7,8-四氫色酮、 5,6,7-三羥基-2-(2-苯乙基)-5,6,7,8,8-五氫色酮等8種色酮化合物。Suzuki等[22]從菲律賓沉香中分離鑒定了2-(2-羥基-2-苯乙基)色酮、 4′,7-二甲氧基- 6-羥基色酮、 4′,6-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮等11種色酮類化合物。

圖2 典型的2-(2-苯乙基)色酮類化合物Fig. 2 Typical 2-(2-phenylethyl)chromone compounds

1.3 三萜類

從沉香中分離得到的三萜類成分包括羥基何帕酮[23]、春藤皂苷元[24]、木栓烷醇、表木醛醇、軟木三萜酮、角鯊烯、 2α-羥基熊果酸和2α-羥基熊果烷[25]，其中典型化合物的結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 典型的三萜類化合物Fig. 3 Typical triterpenoids compounds

2 沉香品質(zhì)檢測和鑒偽技術(shù)

2.1 概述

傳統(tǒng)上的沉香品質(zhì)評價都采用物理評價方式，如沉香樹脂含量、水中下沉程度、色澤、氣味、火試和顯微鑒別等，其中沉香樹脂含量是評價沉香品質(zhì)最通用的方法[26]。但是使用這些方法去鑒別和檢測沉香品質(zhì)還存在一定難度。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)代化的分析檢測手段也被用來定性和定量分析沉香品質(zhì)，如：基于色澤分析的圖像處理系統(tǒng)[27]，基于化學(xué)成分分析的薄層色譜[1,28]、紫外光譜[29-30]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[31-33]、高效液相色譜(HPLC)[34-37]、X射線衍射光譜(XRD)[38]、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)[39-40]、近紅外光譜(NIR)[41]等檢測方式，基于氣味分析的電子鼻檢測[42-43]，基于核酸和蛋白質(zhì)的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[44-45]。

2.2 基于化學(xué)成分分析的檢測方法

2.2.1薄層色譜 薄層色譜是以硅膠、氧化鋁等吸附劑作為固定相，用不同極性溶劑為流動相，將樣品展開后進行分析和分離的方法，具有成本低、耗時短的優(yōu)點，適合用于天然活性物質(zhì)的提取分離及定性鑒別。2010年版《中國藥典》規(guī)定了沉香的薄層色譜鑒別方法：取樣品和沉香粉末各0.5 g，加乙醚30 mL，超聲波處理60 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷2 mL溶解，作為供試品溶液和對照藥材溶液，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷/乙醚(體積比10∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置365 nm紫外光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點[1]。李志俊等[28]取沉香偽品、國產(chǎn)沉香和進口沉香粉末各0.2 g，用1 mL丙酮浸泡約30 min，時時振搖，取浸出液作為點樣供試品，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯/丙酮(體積比9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，用0.5%香草醛硫酸溶液進行噴灑顯色，其中國產(chǎn)沉香和進口沉香均有斑點，但偽品沉香在相應(yīng)顯色處不存在斑點。薄層色譜的鑒別主要通過化學(xué)物質(zhì)在薄層板上的比移值來確定，通過對特征性斑點比移值的對比分析，可以初步確定沉香真?zhèn)危侨绻藶榈膿饺氡纫浦蹬c之相似的化合物，就很難判斷真?zhèn)?，因此需要與其他色譜手段聯(lián)合鑒別。

2.2.2紫外光譜 紫外光譜檢測是根據(jù)樣品中化合物對紫外光的吸收差異而產(chǎn)生形態(tài)、峰位和峰強度等不同的吸收光譜來進行鑒別。黃如棟等[29]在200～300 nm波長范圍內(nèi)對不同沉香樣品的吸光度進行測量，對比分析了進口沉香和偽品沉香的紫外峰形、峰位、相同吸收峰強度等數(shù)值，2類沉香存在顯著差異，進口沉香在206、 209、 222、 237和315 nm處有最大吸收峰，而偽品沉香在206和242 nm處有最大吸收峰，并且其谷位差異較大。李勁松[30]采用紫外光譜法對比分析了國產(chǎn)沉香、野生沉香和人工沉香，結(jié)果表明：國產(chǎn)沉香在(206±2)、(216±2)、(226±2)，(248±2)、(252±2)和(261±2)nm處具有共同吸收峰；野生沉香在(219±1)、(229±1)、(247±1)和(251±2)nm處具有共同吸收峰；人工沉香由于結(jié)香方式不同，具有一定的差異性，鑿洞法和打釘法在203、(217±2)、(230±2)和248 nm處具有共同吸收峰，而輸液法在207 nm處有吸收峰。然而，不同沉香樣品的紫外光譜圖存在很大的相似性，且不同品種或不同結(jié)香方法的紫外光譜圖僅存在細(xì)微的差異，因此采用紫外光譜法鑒別沉香品質(zhì)還存在一定的局限性。

2.2.3氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是測定樣品中揮發(fā)油和植物油等化學(xué)成分的最主要分析方法，具有柱效高、靈敏度高、鑒定速度快和分離能力強等特點，廣泛應(yīng)用于易揮發(fā)性化合物的化學(xué)組成分析。倍半萜和色酮類化合物是沉香中典型的化合物，其種類和含量的變化決定了沉香的香氣和品質(zhì)。楊錦玲等[31]采用GC-MS分析了越南紅土沉香、黃熟香和吊口沉香3種越南產(chǎn)沉香的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)紅土沉香中2-(2-苯乙基)色酮和2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮的GC含量之和高達51.57%，其化學(xué)組成與奇楠沉香接近。Gao等[32]通過GC-MS對沉香中22種化學(xué)成分質(zhì)量變化進行分析，表明人工誘導(dǎo)時間和結(jié)香方法會不同程度導(dǎo)致沉香中倍半萜類化合物緩慢增加，而色酮類化合物快速增加。通過甲酸和真菌接種的結(jié)香方式，沉香的化學(xué)組成與天然結(jié)香的最為接近。吳惠勤等[33]通過固相微萃取(SPME)富集沉香的氣味成分，GC-MS分析天然沉香的6種特征成分(芐基丙酮、對甲氧基芐基丙酮、沉香呋喃、沉香螺旋醇、茅蒼術(shù)醇、白木香醛)，通過沉香樣品中氣味成分的種類及其相對含量與天然沉香特征成分對比，判斷沉香的真?zhèn)巍Ｒ虼送ㄟ^沉香特征化學(xué)成分和指紋圖譜的對比分析，可用來鑒別人工沉香和天然沉香。

2.2.4高效液相色譜 高效液相色譜法是以液體為流動相的色譜技術(shù)，通過對色譜柱、流動相洗脫體系和流速等條件的控制，進行高效分離和靈敏分析，具有分析速度快、樣品消耗少和操作簡單等特點。相比氣相色譜而言，高效液相色譜對沉香化學(xué)成分的分析會更全面，特別是沉香中不易揮發(fā)的化合物。張倩等[34]建立了沉香藥材高效液相色譜-二極管列陣檢測器(HPLC-DAD)的9個特征峰圖譜，選用Diamonsil C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)色譜柱；0.1% 甲酸水(A)-乙腈(B)為流動相，洗脫梯度：0～10 min，15%～20%B；10～19 min，20%～23%B；19～21 min，23%～33%B；21～39 min，33%B；39～40 min，33%～35%B；40～50 min，35%B；50～50.1 min，35%～95%B；流速0.7 mL/min；柱溫30 ℃;檢測波長為 252 nm。陳亞[35]對比分析了11種沉香的HPLC色譜圖，最終確定了沉香藥材的12種特征峰，其中6-羥基-2-[2-(4′-甲氧基苯)乙基]色酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0268%～0.0621%，6-羥基-2-(2-苯乙基)色酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.101 0%～0.148 6%。戚樹源等[36]和何夢玲等[37]通過HPLC建立了色酮類成分的測定方法。采用HPLC可以快速分析沉香中化學(xué)成分，通過對幾種特征峰的變化和含量分析，可以用來鑒別和控制沉香質(zhì)量。但其鑒別的前提是必須有標(biāo)準(zhǔn)化合物進行標(biāo)定分析，目前建立的HPLC分析方法中，可供參考的化合物均為自制，市場上還沒有可供HPLC分析的標(biāo)準(zhǔn)化沉香特征化合物。

2.2.5X射線衍射 X射線衍射是根據(jù)衍射圖譜的幾何拓?fù)湟?guī)律、峰形的特征值和模糊圖象識別原理而建立起來的現(xiàn)代鑒定分析方法，可以從另一個角度綜合分析控制藥材的質(zhì)量，具有快速、簡便、圖譜信息量大和指紋性強等優(yōu)點[46]，廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定和質(zhì)量控制[47-48]。李勁松等[38]采用XRD技術(shù)對國產(chǎn)沉香與白木香進行分析，建立國產(chǎn)沉香X射線衍射Fourier指紋圖譜,通過對國產(chǎn)沉香藥材和白木香X射線衍射圖譜進行計算和分析，8批國產(chǎn)沉香的相似度在0.909 6～0.960 1之間，而白木香與國產(chǎn)沉香的相似度較低，其2θ在10～20°之間也有明顯差異。目前采用X射線衍射法鑒定沉香的研究還不系統(tǒng)，只是采用聚類分析對幾種國產(chǎn)沉香的一致性進行了考察，缺乏更加系統(tǒng)的沉香XRD數(shù)據(jù)庫，包括不同品種、不同產(chǎn)地等。

2.2.6傅里葉變換紅外光譜 傅里葉變換紅外光譜是根據(jù)干涉后的紅外光進行傅里葉變換后得到的單光束光譜，由樣品本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)、電子云分布和幾何構(gòu)型等決定了樣品的結(jié)構(gòu)特征，從而給出不同的頻率、峰強和帶隙。于玥等[39]采用傅里葉紅外光譜法和二階導(dǎo)數(shù)光譜法建立了4種沉香的特征吸收峰，其中，1244 cm-1是黃棋特征峰；1650、 1384、 1246、 1122、 849、 781、 759 cm-1是綠棋特征峰；1602、 1103、 1034、 861和750 cm-1是黑棋特征峰；1638、 1601、 1388、 1272、 1246、 1122、 1032、 965、 847、 780和758 cm-1是紫棋特征峰。Qu等[40]通過對沉香、摻假物質(zhì)(松香樹脂、纖維素和木質(zhì)素等)進行傅里葉變換紅外光譜和二維相關(guān)紅外譜圖的計算和分析，建立了一種快速簡便的沉香摻假篩選模型，該方法準(zhǔn)確、便捷，可應(yīng)用于沉香中摻入松香樹脂和廉價木材的快速鑒別。目前對沉香的傅里葉變換紅外光譜分析還處于初級階段，采用原光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜進行了結(jié)構(gòu)分析、聚類分析和偏最小二乘法判別分析等，如果需要分析沉香的摻假樣品，需要建立更多的沉香樣品和可疑摻假樣品的傅里葉紅外光譜，建立沉香的傅里葉紅外光譜特征數(shù)據(jù)庫，從而判斷是否摻假。

2.2.7近紅外光譜 近紅外光(780～2 526 nm)是指波長介于可見光區(qū)與中紅外光區(qū)之間的電磁波，是由分子振動能級的躍遷而產(chǎn)生的，反映含氫基團C—H、O—H、S—H、N—H等振動的倍頻和合頻吸收，其特征是快速、無需前期預(yù)處理且無損樣品。鐘建理等[41]分析了53批沉香樣品，采用二階導(dǎo)數(shù)法和因子化法建立沉香摻偽品鑒別模型，通過驗證發(fā)現(xiàn)該方法可快速、準(zhǔn)確地鑒別出偽劣沉香。目前，近紅外光譜技術(shù)已成功應(yīng)用于食品基質(zhì)分析，但是在沉香摻假的檢測方面還處于起步階段，對摻假體系的建立還不夠健全。

2.3 電子鼻

電子鼻技術(shù)應(yīng)用于鑒偽始于20世紀(jì)90年代，它模擬了人的嗅覺系統(tǒng)，是一種新穎的分析、識別和檢測具有氣味或揮發(fā)性成分的儀器。Najib等[42]利用電子鼻分析不同品質(zhì)的馬來西亞和印度尼西亞沉香，建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，并用LMBP模式識別算法，正確率達100%。李志遠[43]利用電子鼻和主成分分析法(PCA)研究了沉香和偽劣沉香的電子鼻信息變化特征，采用反向傳播、徑向基函數(shù)、廣義回歸、概率神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和學(xué)習(xí)向量量化神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對相應(yīng)驗證組數(shù)據(jù)進行判別，經(jīng)參數(shù)優(yōu)化后準(zhǔn)確率可達96.3%。利用沉香氣味或揮發(fā)性成分分析探索摻假沉香或偽劣沉香的電子鼻信息特征變化規(guī)律，建立沉香模式識別方法，可提供快速判別的可能性。然而，實際應(yīng)用于沉香鑒別，還存在一定難度，首先電子鼻儀器價格高昂，其次儀器具有漂移性會影響檢測結(jié)果，另外需要大量的沉香樣本建立指紋圖譜庫，但是沉香品種、產(chǎn)地和結(jié)香方式等都可能會影響沉香香氣的變化，因此建立一套全面的沉香指紋圖譜庫存在一定的難度。

2.4 分子生物學(xué)技術(shù)

基于核酸和蛋白質(zhì)的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是鑒別食品和農(nóng)業(yè)摻假的主要技術(shù)手段。近年來，對沉香生物合成途徑的研究取得了很多研究成果。Kumeta等[49]通過構(gòu)建沉香懸浮細(xì)胞DNA文庫，首次從中克隆出沉香愈創(chuàng)木烷型倍半萜合成酶基因。Xu等[50]獲得了主產(chǎn)物為愈創(chuàng)木烯型的倍半萜合成酶蛋白。Lee等[44]采用實時聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)-單核甘酸多態(tài)性(SNPs)技術(shù)檢測馬來西亞沉香、奇楠沉香和土沉香，結(jié)果表明采用PCR技術(shù)能夠有效區(qū)分這3種沉香。高曉霞等[45]探討不同品種沉香間的rDNA ITS2序列差異及系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：沉香種內(nèi)平均K2P遺傳距離為0～0.003，種間平均K2P遺傳距離為0.005～0.023，白木香、人工沉香和商品沉香在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一支，基于ITS2條形碼序列可以準(zhǔn)確鑒別沉香基源植物。鐘志敏等[51]建立了適用于提取不同沉香藥材DNA的方法，通過ITS2序列對沉香藥材進行種質(zhì)資源聚類分析，ITS2序列能準(zhǔn)確鑒別出4個沉香混偽品和2個似沉香物種，15個沉香樣品ITS2序列與泰國沉香、奇楠沉香、土沉香3個沉香物種100%相似，表明通過對沉香DNA條形碼的研究可以用來鑒別沉香資源。采用分子生物學(xué)方法用于沉香鑒偽的優(yōu)勢在于特異性好、靈敏度高，能夠有效辨別沉香摻假率，但是其前期預(yù)處理較復(fù)雜，檢測成本較高。

3 結(jié) 語

沉香的品種繁多，其品質(zhì)因產(chǎn)地和結(jié)香方式的不同存在很大差異，同時受到沉香巨大的價格誘惑，以次充好、以假亂真的沉香比比皆是，因此鑒偽技術(shù)的研究為有效區(qū)分沉香品質(zhì)、打擊不法行為提供了不可或缺的科技支撐。通過對現(xiàn)代化分析檢測手段研究發(fā)現(xiàn)，薄層色譜和紫外光譜是快速鑒別的主要手段，但是這2種方法的精準(zhǔn)度不夠，需要與其他色譜方法相結(jié)合，如氣相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜法等，才能達到理想的鑒別效果；近紅外光譜、X射線衍射、傅里葉變換紅外光譜和電子鼻技術(shù)都是基于樣品特征性譜圖庫數(shù)據(jù)的建立而進行的快速鑒別工具，具有快速無損等特點，但是目前這些技術(shù)還處于實驗研究階段，實際應(yīng)用還需要大量的數(shù)據(jù)分析和模型建立為支撐；分子生物學(xué)的檢測手段最為精準(zhǔn)，也是國際上仲裁食品、農(nóng)產(chǎn)品等鑒偽檢測的主流方法，但實際檢測過程中成本較高。因此，從長遠來看，基于樣品特征性譜圖庫數(shù)據(jù)建立的快速鑒別技術(shù)及其多種技術(shù)結(jié)合使用的方式將是未來沉香鑒偽技術(shù)的發(fā)展趨勢。