基于魯米諾功能化納米金的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器靈敏檢測癌胚抗原

曹俊濤，任秀燕，王玉玲，劉彥明

(信陽師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 信陽 464000)

0 引言

癌胚抗原(CEA)是一種可以引起患者免疫反應(yīng)的抗原，通常由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生. CEA作為一種可以在多種腫瘤中表達(dá)的廣譜性腫瘤標(biāo)志物，與多個(gè)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測可用于臨床多種腫瘤的早期診斷.因此，提出一種新的易操作、靈敏、快速檢測CEA的方法對早期的腫瘤臨床診斷具有十分重要的意義.迄今為止，測定CEA含量的方法主要有方波伏安法[1]、熒光免疫分析法[2]、毛細(xì)管電泳法[3]、酶聯(lián)免疫吸附測定法[4]、放射免疫檢測法[5]等.但是這些方法還存在著一些不足之處，例如耗時(shí)、儀器昂貴、需要配備專業(yè)人員等.

電化學(xué)發(fā)光(ECL)具有響應(yīng)迅速、靈敏度高、背景信號低、選擇性好且易操作等優(yōu)點(diǎn)，已成為近年來人們研究的熱點(diǎn)之一[6-8].魯米諾(luminol)作為一個(gè)高發(fā)光效率試劑，被應(yīng)用于多種分析物檢測[9-11].但是，在不降低發(fā)光效率的情況下將luminol分子固定在電極界面上是比較困難的，這成為了luminol試劑在ECL傳感領(lǐng)域應(yīng)用的一個(gè)障礙.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，金納米顆粒(Au NPs)具有優(yōu)良的生物相容性，且通過Au-N化學(xué)鍵之間的弱相互作用以及Au NPs與luminol所帶正負(fù)電荷的靜電作用，Au NPs可以與luminol結(jié)合在一起形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu).此外，Au NPs具備良好的導(dǎo)電性、較大的比表面積以及對luminol氧化的良好的電活性，故其對luminol-H2O2發(fā)光體系表現(xiàn)出顯著的催化性能[11].因此，使用魯米諾功能化的金納米顆粒(L-Au NPs)作為基底材料構(gòu)建ECL傳感器能夠得到令人滿意的結(jié)果.

基于此，我們采用一鍋法成功制備了L-Au NPs復(fù)合材料，以L-Au NPs-H2O2為ECL發(fā)光體系，結(jié)合適配體的特異性識別作用構(gòu)建了一個(gè)ECL適配體傳感器.利用CEA在電極界面對ECL信號的抑制作用，提出了一個(gè)以L-Au NPs為基底材料測定CEA的電化學(xué)發(fā)光新方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器裝置

RST5200F電化學(xué)工作站(鄭州世瑞思儀器科技有限公司)；BPCL-1-IC微弱發(fā)光測量儀(中國科學(xué)院生物物理研究所)；UVmini-1240型紫外可見分光光度計(jì)(Shimadzu，日本)；JEM-2100F型200 kV場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM，日本電子株式會(huì)社JEOL，日本).ECL信號測量均在三電極系統(tǒng)中進(jìn)行，以鉑盤電極作為輔助電極，以Ag/AgCl為參比電極，將經(jīng)過修飾的玻碳電極(GCE)作為工作電極.

1.2 試劑與溶液

NaBH4，天津市巴斯夫化工有限公司；HAuCl4·4H2O、殼聚糖(CS)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；戊二醛(GLD)，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；CEA，鄭州免疫生物技術(shù)有限公司； CEA的適配體(aptamer)5′-NH2-(CH2)6-TTT TAT ACC AGC TTA TTC AAT T-3′，生工生物工程(上海)股份有限公司合成；人免疫球蛋白G(hIgG)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清蛋白(BSA)，上海索萊寶生物科技有限公司(Seebio Biotechnology)；0.1 mol/L魯米諾(luminol，SIGMA-ALDRICH)儲(chǔ)備液，用0.1 mol/L的NaOH配制；H2O2溶液，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4，PBS)，由0.1 mol/L KH2PO4-Na2HPO4，0.1 mol/L KCl構(gòu)成.實(shí)驗(yàn)過程中所用水均為18.25 MΩ·cm純水(臺灣艾柯-成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠).

1.3 檢測方法

將4 mL含有30 mmol/L H2O2的PBS溶液(pH=7.4)加入到檢測池中，接著分別把輔助電極、參比電極、工作電極浸入檢測底液中構(gòu)成三電極體系.使用RST5200F電化學(xué)工作站、BPCL-1-IC微弱發(fā)光測量儀對修飾好的工作電極進(jìn)行ECL信號的測量.測得的ECL信號強(qiáng)度與CEA濃度的對數(shù)成負(fù)相關(guān).用相同的方法測得其他標(biāo)準(zhǔn)溶液的信號強(qiáng)度，即可得出CEA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線.然后使用該方法對實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到樣品中的CEA濃度.

1.4 L-Au NPs的合成

L-Au NPs使用文獻(xiàn)[12]中的方法的合成.合成之前，將所有需要用到的玻璃器皿用王水浸泡處理12 h以上，取出并清洗后再用超純水浸泡2 h.將冰凍的4 mL 0.01 mol/L luminol溶液和0.6 mL 0.1 mol/L NaBH4溶液在磁力攪拌狀態(tài)下加入20 mL含有2.5×10-4mol/L的HAuCl4水溶液中，在冰浴中持續(xù)攪拌10 min，此時(shí)，溶液會(huì)立即變?yōu)樯钭霞t色.此后，將該反應(yīng)置于室溫下持續(xù)攪拌6 h，制得L-Au NPs.

1.5 傳感器的構(gòu)建

首先將玻碳電極依次用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末進(jìn)行拋光處理，然后在乙醇和水中超聲清洗，氮?dú)獯蹈?將8 μL合成的L-Au NPs滴加到已拋光和清潔干凈的裸玻碳電極上，在60 ℃的烘箱中烘干.接著，將8 μL 0.05 g/L的CS滴加在電極界面上，得到L-Au NPs/CS復(fù)合膜，使得L-Au NPs在電極界面不易脫落.在CS/L-Au/GCE電極上滴加8 μL 5%的GLD，常溫下放置30 min，使之充分結(jié)合.滴加8 μL的1.0×10-7mol/L識別分子NH2-aptamer，在4 ℃的冰箱中放置12 h，通過適配體5′端的氨基與戊二醛的醛基之間發(fā)生的醛胺縮合反應(yīng)，達(dá)到固定識別分子的目的.在此基礎(chǔ)上，用0.1%的BSA對電極界面非特異性結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉，即得到ECL適配體傳感器.最后，在電極上滴加8 μL一系列不同濃度的CEA，37 ℃下孵育1 h，用水輕輕沖洗晾干后，就可以用于對CEA的ECL信號強(qiáng)度檢測.電極修飾過程見圖1.

在ECL信號測量過程中，以30 mmol/L H2O2的PBS溶液(pH=7.4)作為檢測底液，掃描電壓為0.2 V～0.8 V，掃速為50 mV/s，光電倍增管高壓為-800 V.

圖1 ECL適配體傳感器構(gòu)建示意圖Fig. 1 Schematic illustration for the construction of ECL aptasensor

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

圖1展示了傳感器的構(gòu)建過程及該檢測體系的原理，可能的反應(yīng)機(jī)理如下：

在電激發(fā)下，luminol被氧化為luminol自由基，隨后自由基與H2O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成3-氨基鄰苯二甲酸離子激發(fā)態(tài)(3-aminophthalate ion*)，接著激發(fā)態(tài)釋放能量，生成3-氨基鄰苯二甲酸離子(3-aminophthalate ion)并發(fā)出波長為425 nm的光.

當(dāng)不同濃度的CEA存在時(shí)，不同數(shù)量的CEA分子與識別分子特異性相結(jié)合，產(chǎn)生不同的空間位阻，對電子的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生了不同程度的阻礙.濃度越大，目標(biāo)分子與識別分子結(jié)合的就越多，導(dǎo)致阻礙越大，ECL信號被淬滅的越多，ECL信號強(qiáng)度也就越低.

2.2 L-Au NPs的表征

利用TEM對L-Au NPs的形貌、分散程度進(jìn)行表征.如圖2A所示L-Au NPs呈球狀，平均粒徑在6 nm左右，呈現(xiàn)出較好的形貌.luminol和L-AuNPs的紫外吸收光譜如圖2B所示.由圖可知，L-Au NPs在波長300 nm和355 nm處展現(xiàn)出luminol的特征吸收峰，在波長525 nm處展現(xiàn)出Au NPs的特征吸收峰，表明L-Au NPs的成功制備.

圖2 (A)L-Au NPs的TEM圖；(B)luminol(a)和L-Au NPs(b)的UV-vis吸收光譜圖Fig. 2 (A) TEM image of L-Au NPs; (B) UV-visspectrum of luminol (a), L-Au NPs (b)

2.3 傳感器表征

利用電化學(xué)(交流阻抗譜)和ECL方法對傳感器的層層組裝過程進(jìn)行了表征.交流阻抗在含有0.1 mol/L KCl 的5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)的檢測液中進(jìn)行.如圖3A所示，隨著L-AuNPs/CS、GLD、aptamer、BSA、CEA的依次修飾，電極界面的阻抗逐漸增大.這是由于生物分子的空間位阻、差的導(dǎo)電性能對電子轉(zhuǎn)移、氧化還原探針在電極界面的擴(kuò)散的阻礙作用，導(dǎo)致電極界面電阻增加，電極交流阻抗信號逐步升高.電極界面交流阻抗變化說明該ECL適配體傳感器構(gòu)建成功.同時(shí)，傳感器層層修飾過程中ECL變化趨勢(見圖3B)也進(jìn)一步印證了電化學(xué)阻抗所得結(jié)果，說明了該傳感器的成功構(gòu)建.

圖3 在電極不同修飾階段的EIS(A)和ECL(B)表征Fig. 3 The curves of EIS (A) and ECL (B)characterization of electrodes at different modify stages :the bare GCE (a) , CS/L-Au/GCE (b) , aptamer/GLD/CS/L-Au/GCE (c) , BSA/aptamer/GLD/CS/L-Au/GCE (d) ,CEA/BSA/aptamer/GLD/CS/L-Au/GCE (e)

2.4 傳感器的分析性能

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，以CEA為目標(biāo)分子，對一系列濃度的CEA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了檢測，見圖4.

圖4 不同濃度的CEA的ECL強(qiáng)度(A)和濃度校準(zhǔn)曲線(B)Fig. 4 ECL calibration curve (A) and Intensityconcentration curve (B) at various concentrationsof CEA : (a - i) 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0 and 5.0 μg/L

由圖4可知，ECL信號強(qiáng)度(I)與CEA濃度的對數(shù)(lgCCEA)呈良好的線性關(guān)系，線性范圍為5.0×10-10～5.0×10-6g/L，線性方程為I=-9635.53-1273.88 lgCCEA(CCEA為CEA濃度，kg/L)，相關(guān)系數(shù)R2=0.998.計(jì)算得出傳感器對CEA的檢出限為1.8×10-10g/L.

2.5 傳感器的特異性和重現(xiàn)性

以hIgG、HSA為干擾蛋白，考察了傳感器的特異性.結(jié)果表明，用傳感器分別與hIgG、HSA孵育后，傳感器ECL響應(yīng)與空白溶液ECL響應(yīng)無明顯差別.將傳感器與hIgG、HSA與CEA的混合液孵育，其ECL響應(yīng)與單獨(dú)孵育0.1 μg/L CEA所得ECL響應(yīng)一致，充分說明該傳感器有良好的選擇性.利用批內(nèi)檢測和批間檢測考察了傳感器的重現(xiàn)性.同一批次5個(gè)傳感器對1.0×10-7g/L CEA 的響應(yīng)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.4%，不同批次5個(gè)傳感器對1.0×10-7g/L CEA的響應(yīng)RSD為7.8%.

2.6 實(shí)際樣品分析

將傳感器用于人血清樣品(取自信陽市中心醫(yī)院)中CEA含量的測定，并用羅氏ECL檢測法作為參考進(jìn)行比較(如表1).結(jié)果表明，相對誤差為- 2.5%～2.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.7%～4.9%. 將3個(gè)不同濃度水平的CEA標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×10-9g/mL，5.0×10-8g/L，1.0×10-6g/L)分別加入兩個(gè)血清樣品中，回收率在85.3%～113.6%之間.

表1 人體血清中CEA含量的測定結(jié)果Tab. 1 Detection results of CEA in human serum sample

3 結(jié)論

基于L-Au NPs-H2O2體系強(qiáng)的ECL發(fā)光性能，以L-Au NPs為ECL發(fā)光劑構(gòu)建無標(biāo)記性ECL適配體傳感器，利用CEA對ECL的抑制作用，建立了一種靈敏、快速、簡便測量CEA的ECL新方法，并應(yīng)用于人體血清的測定.研究結(jié)果表明，該方法在臨床診斷中具有良好的應(yīng)用前景.