AM真菌對(duì)藍(lán)莓根際微生態(tài)的影響*

潘 霞， 韓薛婧娉， 陳僑月， 楊 莉， 朱友銀， 郭衛(wèi)東， 陳文榮

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

0 前 言

藍(lán)莓(Vacciniumspp.)為杜鵑花科越桔屬漿果類經(jīng)濟(jì)植物，其果實(shí)內(nèi)富含花青素等物質(zhì)，具有提高視力、延緩衰老及防癌等功效，被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一，近幾年引起廣泛關(guān)注[1].藍(lán)莓雖然有近百年的商業(yè)種植歷史，但我國藍(lán)莓種植起步較晚，近年來，浙江等南方省份藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，但栽培相關(guān)配套技術(shù)研究卻嚴(yán)重滯后，目前僅有少量有關(guān)于藍(lán)莓品種篩選及果實(shí)品質(zhì)特性的研究報(bào)道[2].藍(lán)莓根系淺，僅具大量細(xì)根而無根毛；同時(shí)，藍(lán)莓為喜酸性植物，在堿性環(huán)境下容易出現(xiàn)葉片缺鐵性失綠，引起藍(lán)莓生長(zhǎng)不良甚至死亡[3].這些特殊的生物學(xué)特性均與藍(lán)莓根與根際土壤互作關(guān)系密切，在這一相互作用中，AM真菌可能發(fā)揮了重要的作用.

研究表明,接種AM真菌能夠改善植株?duì)I養(yǎng)狀況、促進(jìn)植株生長(zhǎng)[4]、增強(qiáng)植物抗病及抗逆性[5-6]；同時(shí)，AM真菌通過生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)等方式對(duì)土壤微生態(tài)進(jìn)行有益調(diào)節(jié)[5-6].目前,國內(nèi)外對(duì)大豆[6]、玉米[7]等作物的相關(guān)研究較多，對(duì)果樹等木本植物的有限報(bào)道表明，AM真菌對(duì)果樹具有促進(jìn)養(yǎng)分吸收的作用，從而促進(jìn)植株生長(zhǎng)[8].已有研究表明，接種AM真菌后增強(qiáng)了‘奧尼爾’藍(lán)莓對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)能力[9]，接種不同AM真菌能不同程度提高藍(lán)莓的抗寒性[10]，但AM接種后對(duì)藍(lán)莓的生物量生長(zhǎng)及根際微生物的影響仍未見報(bào)道，AM菌侵染規(guī)律等相關(guān)機(jī)理仍缺乏研究.

AM真菌的接種效果取決于菌株、宿主植物、菌株與宿主植物的協(xié)調(diào)性及土壤生態(tài)條件等[11].基于氣候、立地條件等因素的菌種選擇是AM真菌在藍(lán)莓生產(chǎn)上應(yīng)用的關(guān)鍵，浙江等南方省份藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展較晚[2]，目前未見相關(guān)研究報(bào)道.本研究以浙江省主栽藍(lán)莓品種‘布里吉塔’為材料，接種4種AM真菌，從生物量生長(zhǎng)、根系解剖結(jié)構(gòu)等方面研究AM真菌與藍(lán)莓根系的互作；從土壤酶活及微生物多樣性調(diào)查等角度分析AM真菌對(duì)藍(lán)莓根際微生物的生態(tài)結(jié)構(gòu)組成的影響；深入分析AM真菌對(duì)藍(lán)莓生長(zhǎng)的作用機(jī)理，以期明確促進(jìn)藍(lán)莓生長(zhǎng)的AM真菌種類，同時(shí)建立相關(guān)技術(shù)體系，促進(jìn)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展.

1 材料與方法

1.1 植物材料及AM真菌處理

供試的4種AM真菌購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心.以通過組培苗扦插生長(zhǎng)的一年生北高叢藍(lán)莓‘布里吉塔’(Brigitta)作為供試藍(lán)莓材料(取自浙江師范大學(xué)特色經(jīng)濟(jì)植物生物技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，隨機(jī)分成6組，每組10株，按盆栽培養(yǎng)的方法[12]將組培苗移植到滅菌土壤中，分別在植株根部1 cm處接種厚約1 cm的蜜色無梗囊霉、聚叢球囊霉、幼套球囊霉和摩西球囊霉(分別標(biāo)記為A,B,C,D)，另外2組分別用干熱法進(jìn)行滅菌處理(為M組)及空白對(duì)照(為K組).

所有藍(lán)莓苗均置于同一室外條件下，使其在光照充足的26 ℃通風(fēng)環(huán)境下生長(zhǎng)，每2 d澆水1次，每5 d觀察藍(lán)莓長(zhǎng)勢(shì).處理72 d后收獲樣品，稱重，取樣進(jìn)行切片觀察；同時(shí)用抖土法收集根際土進(jìn)行酶活測(cè)定及微生態(tài)的分析(易于從根系上抖落的土壤為土體土壤，和根系緊密結(jié)合不易抖落的土壤為根際土壤).

1.2 AM真菌侵染情況觀察

將72 d收獲后的新鮮藍(lán)莓幼苗洗凈晾干，分別選取各組別粗細(xì)長(zhǎng)短一致的初生根段進(jìn)行切割，置FAA固定液(V(70%乙醇)∶V(冰醋酸)∶V(38%甲醛)=18∶1∶1)中充分浸透，固定3 h.將固定好的材料在70%乙醇中放置12 h后，依次經(jīng)過70%，85%，95%直至100%乙醇的脫水處理，每次時(shí)間為2 h.經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟等步驟制成藍(lán)莓根系石蠟切片[13]，在光學(xué)顯微鏡下觀察AM真菌對(duì)藍(lán)莓根系的侵染情況[14]，并對(duì)其侵染情況進(jìn)行分析.

1.3 土壤微生物種類多樣性分析

采集的土壤樣品根據(jù)Omega Soil Kit試劑盒說明書進(jìn)行總DNA的提取，總DNA適當(dāng)稀釋后進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中包括10×PCR反應(yīng)緩沖液(MgCl2) 5 μL，10 mmol/L的dNTP溶液4 μL，上下游引物各2 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，DNA模板為2 μL，蒸餾水34 μL.擴(kuò)增程序設(shè)定：94 ℃下預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，經(jīng)過35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，最后在4 ℃條件下保存.擴(kuò)增結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.

第1次PCR：引物為真菌ITS通用引物58Sf-GC 和28S1-r擴(kuò)增，細(xì)菌通用引物534和341-GC擴(kuò)增.以上述PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行再次PCR 擴(kuò)增(Reconditioning-PCR).

第2輪PCR產(chǎn)物濃縮后取15 μL，采用Bio-Rad公司Dcode TM的基因突變檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行DGGE分析.制備DGGE梯度凝膠[15].真菌采用8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為45%～80%(40%的去離子甲酰胺與7 mol/L的尿素的混合物為100%變性劑)；細(xì)菌則采用6%的聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為40%～60%.65 ℃，50 V電泳13 h.電泳完成后，采用銀染法[16]進(jìn)行DGGE膠染色.將觀察到的結(jié)果用Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，并使用Bio-Rad Quantity One軟件對(duì)DGGE條帶進(jìn)行系統(tǒng)分析.

1.4 土壤微生物豐度測(cè)定

采用稀釋涂平板[17]的方法，分別配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基以適合細(xì)菌、放線菌和真菌生長(zhǎng)，制備不同稀釋度的根際土壤懸液.在各培養(yǎng)基中選取稀釋度為10-3，10-4和10-5的土壤菌懸液進(jìn)行接種，分別在適宜溫度下培養(yǎng)至菌落數(shù)穩(wěn)定后，計(jì)算菌落數(shù).同一平板計(jì)數(shù)時(shí)，至少對(duì)其進(jìn)行重復(fù)3次計(jì)數(shù)，然后記錄其平均值.土壤微生物數(shù)量(CFU/g)為每克土壤中的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù).

1.5 土壤酶活性的測(cè)定

采集的土壤樣品風(fēng)干后進(jìn)行酶活性測(cè)定.脲酶活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，其活性以24 h后1 g土壤中NH3-N的mg數(shù)表示[18]；蔗糖酶與纖維素酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法，活性分別以24 h后1 g干土生成的葡萄糖mg數(shù)，以及72 h后1 g干土生成的葡萄糖mg數(shù)表示[19]；過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法，活性以每g干土1 h內(nèi)消耗的0.1 mol/L KMnO4體積數(shù)表示[19].

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測(cè)定，至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，并進(jìn)行方差分析.主要應(yīng)用方差分析、最小差異顯著性(鄧肯氏新復(fù)極差法)檢驗(yàn)(P<0.05)、T檢驗(yàn)這3種方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，均采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌處理對(duì)藍(lán)莓植株生長(zhǎng)的影響

與滅菌處理組(M組)相比，4種AM真菌處理后的藍(lán)莓生長(zhǎng)量普遍提高，這種對(duì)生物量的促進(jìn)作用在地下部尤為顯著；而在地上部，僅B，C組顯著高于對(duì)照組(K組)，分別為對(duì)照組的169%及170%.4種候選AM真菌中，聚叢球囊霉(G.agregatum，即B組)的接種對(duì)藍(lán)莓植株生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最明顯，地下部分及地上部分別為對(duì)照組的1.12和1.29倍，而接種蜜色無梗囊霉對(duì)藍(lán)莓植株生長(zhǎng)的效果與對(duì)照組無顯著差異.

不同小寫字母表示同一品種不同處理在P<0.05水平上呈顯著差異

2.2 藍(lán)莓根系A(chǔ)M真菌侵染影響

接種AM菌72 d后，從石蠟切片的顯微結(jié)構(gòu)觀察到，AM真菌在藍(lán)莓根中形成泡囊、叢枝及菌絲，表明叢枝真菌與藍(lán)莓根系建立了明顯的的共生關(guān)系(見圖2).而對(duì)照組及滅菌處理組內(nèi)的菌絲與泡囊均很少見，呈現(xiàn)正常的根縱切圖.菌絲可存在于根外及細(xì)胞間隙中，也可存在于細(xì)胞內(nèi)；菌根形成泡囊結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)為球形和橢圓形，分布在根的皮層.根系的泡囊豐度代表了泡囊在整個(gè)根系中的豐富程度，圖2中c為B菌接種的藍(lán)莓根內(nèi)典型細(xì)胞圖，泡囊密度顯著高于其他菌株處理及空白對(duì)照.各處理組樣品侵染程度有所差別，B組顯著高于其他組別.藍(lán)莓菌根侵染率分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)與侵染強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[20].侵染后供試植株的孢子數(shù)量也存在顯著差異，接種聚叢球囊霉(B組)的孢子數(shù)量最高，平均為38個(gè)，而A組、C組和D組的平均孢子數(shù)分別為17個(gè)、26個(gè)和21個(gè)(見表1).

a～f分別為：根外菌絲、根內(nèi)菌絲及叢枝、泡囊、侵入點(diǎn)、M組根系切片和K組根系切片

表1 接種不同AM真菌后藍(lán)莓根際菌根侵染率

組別AM菌種菌根侵染率/%侵染等級(jí)侵染強(qiáng)度孢子數(shù)量A蜜色無梗囊霉(A. mellea)20.82弱17B聚叢球囊霉(G. aggregatum)25.12弱38C幼套球囊霉(G. Etunicatum)22.72弱26D摩西球囊霉(G. mosseae)21.22弱21

2.3 AM真菌處理對(duì)藍(lán)莓根際土壤微生物量的影響

經(jīng)AM真菌處理后的藍(lán)莓根際微生物的分布發(fā)生大幅度的改變，其中細(xì)菌的分布顯著減少，而放線菌與真菌的分布大幅度增加(見圖3).與未處理的藍(lán)莓組相比，接種蜜色無梗囊霉(A組)的處理放線菌、真菌、細(xì)菌分別為對(duì)照的197.1%，157.4%及61.5%；接種聚叢球囊霉(B組)相應(yīng)變化率為275.5%，189.3%及8.3%；另2個(gè)菌接種后微生物多樣性變化率介于以上二者之間.由此可見，AM真菌接種促使根際微生態(tài)向“真菌型”發(fā)展.

不同小寫字母表示同一品種不同處理在P<0.05水平上呈顯著差異

2.4 PCR-DGGE 法探究根際微生物多樣性

變性梯度凝膠電泳(DGGE)能夠分離PCR產(chǎn)物中不同堿基序列的片段，由此得到數(shù)目及位置各不相同的電泳條帶，從而用來分析菌群結(jié)構(gòu)在不同處理下的差異性及多樣性.DGGE中的每一個(gè)條帶都和菌群中的某一優(yōu)勢(shì)群落或操作分類單元(operational taxonomic unit，OUT)相對(duì)應(yīng)，條帶數(shù)目與微生物多樣性的豐富程度相對(duì)應(yīng)，而染色后DGGE條帶的亮度越亮，則說明了該種群數(shù)量越多，從而能夠反映土壤中微生物的種類和數(shù)量.

圖4 16S rRNA V3擴(kuò)增片段的DGGE圖譜 圖5 ITS rRNA擴(kuò)增片段的DGGE圖譜

由DGGE結(jié)果可知，各處理PCR產(chǎn)物通過變性梯度凝膠電泳得到了有效地分離，每一條泳道上都出現(xiàn)了大量條帶.對(duì)所得到的DGGE圖譜進(jìn)行Quantity one軟件分析，結(jié)果顯示,在不同處理?xiàng)l件下土壤DGGE圖譜上條帶的數(shù)目不等，位置也存在一定差異，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)處理組有許多公共條帶，且這些條帶在亮度上變化不大(見圖4)，這表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)單一，與對(duì)照組相比，4個(gè)處理組的細(xì)菌豐富度變化不明顯；真菌群落結(jié)構(gòu)處理組A，B，C，D與對(duì)照組M，K相比,有明顯差異.對(duì)DGGE數(shù)據(jù)分析可知(見圖5)，不同處理組之間存在某些特有條帶，這表明不同處理下，土壤中真菌種群的構(gòu)成發(fā)生了改變，真菌類型出現(xiàn)了不同程度的增加或減少.對(duì)比各處理間的公共條帶，發(fā)現(xiàn)有些條帶的亮度產(chǎn)生了明顯的差異，這說明這些共有的真菌種群在數(shù)量上發(fā)生了變化.從總體上看，真菌群落變化較大，4個(gè)處理組均比對(duì)照組豐富度高且處理組之間差異較明顯，真菌類型發(fā)生了改變，說明不同的真菌對(duì)藍(lán)莓土壤中的真菌群落結(jié)構(gòu)的影響不同，從而改變了土壤中的真菌群落結(jié)構(gòu).

2.5 AM真菌對(duì)土壤酶活的影響

4種AM菌株均顯著提高藍(lán)莓根際土壤的纖維素酶、蔗糖酶及過氧化氫酶活性，其中蜜色無梗囊霉(A組)處理下的藍(lán)莓根際土壤中纖維素酶活達(dá)到最大值為5 U；4種AM菌種相較而言，蜜色無梗囊霉(A組)和幼套球囊霉(C組)對(duì)纖維素酶活的促進(jìn)要高于另外2個(gè)菌種(見圖6).4種AM菌種處理之間對(duì)藍(lán)莓根際蔗糖酶及過氧化氫酶均有促進(jìn)作用，但4種菌株間無顯著差異.接種4種AM真菌中，僅聚叢球囊霉對(duì)脲酶酶活性產(chǎn)生顯著影響.

不同小寫字母表示同一品種不同處理在P<0.05水平上呈顯著差異

3 討 論

藍(lán)莓作為淺根系植物，根系結(jié)構(gòu)獨(dú)特，僅具細(xì)根而無根毛，目前普遍認(rèn)為根部共生的AM真菌對(duì)其養(yǎng)分吸收發(fā)揮了重要作用[21].但也有研究表明，AM真菌與兔眼及高叢藍(lán)莓的互作對(duì)其生物量的生長(zhǎng)均無明顯作用[22-23].本研究中，4種AM真菌處理后的藍(lán)莓生長(zhǎng)量普遍提高，對(duì)生物量的促進(jìn)作用在地下部尤為顯著，表明AM真菌對(duì)藍(lán)莓生產(chǎn)普遍具有積極的意義.4種候選AM真菌菌種中，聚叢球囊霉(即B組)的接種對(duì)藍(lán)莓生長(zhǎng)促進(jìn)作用最大，這與高麗霞等[24]的研究結(jié)果相一致.AM接種效果受菌株及土壤生態(tài)條件等多重因素影響[9]，球囊霉屬的適應(yīng)范圍最廣、能力最強(qiáng)，pH 5.0～9.0的土壤中均有分布[25]，本研究中的聚叢球囊霉很可能更加適應(yīng)藍(lán)莓根際微環(huán)境.

AM真菌侵染宿主植物根系形成菌根后，顯微切片能夠較好地顯示侵染結(jié)果.本研究中，雖然4種AM真菌對(duì)藍(lán)莓根系的侵染率較弱，但根系在光學(xué)顯微鏡下均能觀察到明顯的叢枝菌根真菌的菌絲、泡囊，其可存在于細(xì)胞中，也可存在于細(xì)胞間隙[26]；同時(shí)在根部皮層結(jié)構(gòu)內(nèi)可觀察到典型的泡囊結(jié)構(gòu)，呈球形和橢圓形.聚叢球囊霉(即B組)接種后的藍(lán)莓細(xì)根中泡囊密度及頻度均最高，侵染率達(dá)25.1%，表明其在根內(nèi)的豐富度最大[27]，這可能是該處理組生物量生長(zhǎng)最大的重要原因.

植物與AM真菌的共生關(guān)系還可能通過調(diào)節(jié)根際微生物多樣性間接影響宿主植物的生長(zhǎng)[28].本研究中，AM真菌對(duì)藍(lán)莓土壤中的真菌群落生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用，同時(shí)，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)“真菌化”現(xiàn)象，即形成真菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性增加、細(xì)菌菌群豐度減少的趨勢(shì).龔娜等[32]研究發(fā)現(xiàn)，接種真菌促生菌液使根際細(xì)菌數(shù)量顯著減少，真菌數(shù)量有所增加，這與筆者的研究結(jié)果相一致.一般而言，以真菌為主的根際微生物結(jié)構(gòu)更加有利于植物生長(zhǎng)[11]，據(jù)此推測(cè)AM真菌接種藍(lán)莓后通過生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)方式將有害菌生長(zhǎng)勢(shì)弱化，從而使有益菌成為優(yōu)勢(shì)菌種[29].

土壤酶主要來自微生物及植物根系分泌等途徑，蔗糖酶和纖維素酶參與蔗糖及纖維素等糖類的降解，其活性可表征土壤生物學(xué)活性強(qiáng)度及評(píng)價(jià)土壤熟化程度和土壤肥力[30].本研究中，4種AM菌株均顯著提高藍(lán)莓根際土壤的纖維素酶、蔗糖酶，表明AM真菌可通過增加有益菌群而促進(jìn)土壤酶活的改變，達(dá)到增加土壤可溶性營養(yǎng)的目的.許慶龍[9]研究發(fā)現(xiàn)接種AM真菌后提高了藍(lán)莓植株根圍土壤酸性磷酸酶、脲酶和過氧化氫酶活性，尤以聚叢球囊霉處理明顯.過氧化氫酶能將H2O2分解成H2O和O2，對(duì)動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝活動(dòng)具有保護(hù)作用[31]，AM真菌對(duì)其活性的提高作用有利于根部的抗氧化保護(hù).本研究采用的4種AM菌株中僅聚叢球囊霉(即B組)接種后脲酶活性顯著高于空白對(duì)照，從側(cè)面反映了聚叢球囊霉可對(duì)根際土壤進(jìn)行有益調(diào)節(jié).

由此可見，藍(lán)莓根系接種AM真菌后能形成共生體系，此種共生關(guān)系能夠顯著改善根際微生態(tài)環(huán)境，使根際微生物向“真菌型”轉(zhuǎn)變，有益微生物的增加還可使蔗糖酶等土壤有益酶酶活提高，增強(qiáng)了根際可溶性營養(yǎng)，并最終促進(jìn)藍(lán)莓的生物量生長(zhǎng).