最小體積法玻璃化保存的研究進展

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海 200093)

低溫環(huán)境下，細胞或組織的代謝活動會削弱甚至完全停止。低溫環(huán)境為細胞、組織的長期有效儲存提供條件，使其可廣泛應(yīng)用于組織工程、再生醫(yī)學(xué)和輔助生殖等多個領(lǐng)域[1]。目前實現(xiàn)細胞低溫保存的方法有慢速冷凍法和玻璃化法。慢速冷凍法于20世紀(jì)70年代早期出現(xiàn)，它是先將凍存管放在程序降溫盒中以1～2 ℃/min的降溫速率緩慢降至某一中間溫度，然后置于液氮中保存。慢速冷凍法需要1～2 mol/L[2]的低溫保護劑(cryoprotectant agents，CPAs)，冷凍過程中易形成冰晶，冰晶對細胞結(jié)構(gòu)具有破壞作用[3]，保存效果不理想。玻璃化是將液體直接轉(zhuǎn)化為非晶態(tài)(玻璃態(tài))的固體，在此過程中無冰晶形成。與慢速冷凍法相比，玻璃化法需要更高的CPAs濃度，如6～8 mol/L，以及更高的降溫速率，如105℃/min[4]。

實現(xiàn)玻璃化有兩種方法，一種是提高CPAs濃度，另一種是提高冷卻速率。高濃度CPAs會對細胞造成滲透休克及毒性損傷，具有致命性損傷[4]，因此該方法有較大的局限性。研究表明，實現(xiàn)玻璃化過程中，降溫速率與保護劑濃度間存在一定對應(yīng)關(guān)系，降溫速率越高，實現(xiàn)玻璃化所需要的CPAs濃度越低。理論顯示，當(dāng)冷卻速度大于106℃/s時，甚至純凈水也可以實現(xiàn)玻璃化[5]。提高降溫速率有兩種方法：1)提高傳熱系數(shù)，如將液滴直接噴入液氮中或優(yōu)化載體傳熱特性。Y. S. Song等[6]發(fā)現(xiàn)液滴與液氮直接接觸時，液滴表面易形成一層氮氣膜，這層薄膜會降低熱傳遞效率，降溫速率并未得到明顯提升。采用優(yōu)化載體傳熱特性的方法，如石英毛細管法，對胚胎干細胞玻璃化，降溫速率高于105℃/min，在較低的CPAs濃度下，如2 mol/L丙二醇和0.5 mol/L海藻糖即可實現(xiàn)玻璃化[5,7-8]；2)通過降低微滴體積提高降溫速率。研究表明，當(dāng)微滴尺寸降低至0.1 uL時,微滴從表面到中心的降溫速率均超過105℃/min[9-10]，能成功實現(xiàn)玻璃化。

最小體積法玻璃化保存，即通過降低微滴體積實現(xiàn)玻璃化。微滴體積足夠小時，可顯著提高降溫速率，減少玻璃化所需的CPAs濃度，有助于提高保存后細胞的活性和功能。本文綜述了最小體積法玻璃化保存的最新研究進展，包括有載體的微滴玻璃化保存、噴射微滴玻璃化保存、生物打印微滴玻璃化保存、微流體封裝微滴玻璃化保存。其中，噴射微滴玻璃化保存、生物打印微滴玻璃化保存及微流體封裝微滴玻璃化保存，是將新型的微滴產(chǎn)生技術(shù)與玻璃化保存技術(shù)相結(jié)合。因其能迅速產(chǎn)生大小均勻的微滴，具有高通量的特點[9-11]，在低溫保存領(lǐng)域具有很好的發(fā)展前景。

1 有載體的微滴玻璃化保存

目前，最小體積法玻璃化保存的研究大都集中于有載體的微滴玻璃化保存，如開放式拉伸麥管法(open pulled straw，OPS)[1]，半麥管法(Hemi-straw)[8]，冷凍環(huán)法(Cryoloop)[8]，石英毛細管法(quartz microcapillary，QMC)[3]，Cryotop法[8]，電鏡銅網(wǎng)法(electron microscopic grids，EMG)[12]等，如圖1所示?；谳d體的微滴玻璃化保存需靠載體影響傳熱，因此載體的選擇至關(guān)重要，通常選導(dǎo)熱性良好的材質(zhì)。通過合理設(shè)計載體幾何結(jié)構(gòu)，使所容納的冷凍液體積盡可能少，以提高降溫速率。如EMG是以銅紗網(wǎng)作為冷凍載體，冷凍時，將小于1 uL含細胞的微滴滴在銅紗網(wǎng)上，然后將其直接投入液氮中以實現(xiàn)高的冷凍速率，冷卻速率約為3 000 ℃/min[13]。OPS[14]是利用虹吸原理將含有細胞的微滴吸入拉伸麥管細端，然后快速投入液氮中進行冷凍，降溫速率約16 000 ℃/min。Hemi-straw是將0.25 mL的麥管開口端剪成長1 cm，寬0.5 mm的薄片，冷凍時將含有細胞的冷凍液直接移到薄片上，該方法克服了OPS易漂浮的缺點。由于冷凍液與液氮接觸面增加，降溫速率明顯提升，超過20 000 ℃/min[12,15-16]。Cryotop采用一個很窄的塑料薄膜帶作為冷凍載體，連接一根硬塑料桿作為手柄，并帶有一個安全帽。冷凍時，含有細胞的微滴被加載在薄膜帶上，然后用毛細管將細胞周圍的溶液全吸走，直到留一層薄薄的膜足夠覆蓋細胞，迅速插入液氮冷凍。采用這種方法降溫速率可達40 000 ℃/min[17-19]。QMC是選取傳熱速率更好的石英材料制作微管，管外徑為0.2 mm，厚度為0.01 mm，可實現(xiàn)更快的降溫速率，超過250 000 ℃/min[5]。 Cryoloop是借助表面張力在尼龍線圈上形成一層冷凍液薄膜，由于缺少固體物的支持，樣本降溫速率高達700 000 ℃/min[20-21]。

(a)拉伸麥管法OPS[1]；(b)半麥管法Hemi-straw[8]；(c)冷凍環(huán)法Cryoloop[8]；(d)石英毛細管法QMC[3]；(e)Cryotop法[8]；(f)電鏡銅網(wǎng)法EMG [12]。圖1 有載體的微滴玻璃化保存方法Fig.1 Methods of carrier-based droplets vitrification preservation

有載體的微滴玻璃化保存主要應(yīng)用于卵母細胞和胚胎的玻璃化保存。采用不同載體玻璃化保存的結(jié)果，如表1所示?？芍ＡЩ４媛涯讣毎麜r，不同載體對卵母細胞的保存效果有很大差異。如 M. Kuwayama等[17-18]對牛卵母細胞玻璃化保存，相較于OPS，采用Cryotop保存的卵母細胞受精率和囊胚發(fā)育率更高，且紡錘體結(jié)構(gòu)和染色體形態(tài)更正常。J. K. Choi等[22]采用QMC玻璃化保存卵母細胞，相較于采用Hemi-straw[16]，所用的CPAs濃度降低，且保存后卵母細胞的發(fā)展?jié)摿Ω?。有載體的微滴玻璃化保存也可用于干細胞等小體積細胞，如He Xiaoming等[5]采用QMC玻璃化保存鼠胚胎干細胞。但每次僅可對少量的細胞進行玻璃化保存，且均需手動操作，對用于再生醫(yī)學(xué)和組織工程等臨床需求量較大的細胞，有載體的微滴玻璃化保存方法往往不可行，應(yīng)用范圍受限。

表1 有載體的微滴玻璃化保存結(jié)果Tab.1 The results of carrier-based droplets vitrification

注：表中v/v為體積分?jǐn)?shù)，w/v為質(zhì)量濃度。

2 噴射微滴玻璃化保存

噴射微滴玻璃化保存，是利用裝置的噴嘴將含有細胞的懸浮液離散成微滴，然后在液氮中進行玻璃化保存。采用此方式噴射出的微滴呈無序狀態(tài)。U. Demirci等[23-26]曾提出采用聲學(xué)驅(qū)動微機械噴射器產(chǎn)生液滴，該噴射陣列的每個元素均由一個彎曲單晶硅圓薄膜構(gòu)成，膜中心刻蝕一個孔。通過聲波驅(qū)動壓電換能器，使膜發(fā)生共振位移，即可噴射出微滴。采用該裝置進行水噴射實驗，在0.47、1.24、2.26 MHz頻率下操作，產(chǎn)生的液滴直徑相應(yīng)為6.5、5.0、3.5 μm。該裝置產(chǎn)生的微滴尺寸微小，但缺點是當(dāng)噴射液體濃度增大時易導(dǎo)致噴嘴堵塞。隨后，U. Demirci等[27]又提出一種開放式無噴嘴噴射系統(tǒng)。該裝置由交錯的金屬環(huán)按需產(chǎn)生聲波，聲波在微流道中空氣和流體之間的界面聚焦，產(chǎn)生液滴。該裝置可產(chǎn)生直徑約37 μm的微滴，成功應(yīng)用于胚胎干細胞、成纖維細胞、AML-12肝細胞、人類Raji細胞和HL-1心肌細胞等不同類型細胞，且噴射后細胞活性均超過89.8%。裝置每秒可生成10 000個微滴，具有高通量特點。但是由于該裝置為開放式聚焦，聲波不宜形成徑向耦合，因此不利于穩(wěn)定噴射。

J. Samot等[28]提出了納升級噴射微滴玻璃化保存系統(tǒng)。該系統(tǒng)由氮氣流輸送裝置、已加載CPAs的細胞懸浮液注射裝置、薄膜收集裝置三部分構(gòu)成。噴嘴由200 μL移液槍頭和27G斜口針頭制作而成。其制作步驟是，距槍頭尖端2 cm處從側(cè)面插入27G針頭，槍頭尖端切去2 mm，針頭露出尖端2 mm。槍頭敞口端連接內(nèi)徑3.2 mm的連接管輸入氮氣流；27G針頭端輸入已加載好CPAs的細胞懸浮液，懸浮液注射速度由微注射泵控制。進行噴射實驗時，由氮氣流和含有細胞的懸浮液構(gòu)成共流，利用氮氣流將含有細胞的懸浮液吹打成微滴。產(chǎn)生的微滴用直徑8.5 cm聚乙烯薄膜接收，然后用鑷子夾取薄膜放入液氮中進行玻璃化。R. E. Assal 等[29]將該系統(tǒng)應(yīng)用于紅細胞玻璃化保存，研究氮氣流速、懸浮液注射速度、聚乙烯薄膜接收位置三個參數(shù)對微滴大小的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)獨饬魉僭O(shè)置為3 L/min、注射泵流速設(shè)置為200 μL/min、聚乙烯薄膜距噴嘴6～9 cm處時，此時收集到的液滴尺寸最小，微滴直徑(55±14) μm。然后將噴有微滴的聚乙烯薄膜浸入無菌液氮中進行玻璃化保存，結(jié)果顯示，在低濃度保護劑4.5%(v/v)四氫嘧啶中，含有紅細胞的微滴即可實現(xiàn)玻璃化，且復(fù)溫后細胞活性較高。Zhang X.等[30]將該系統(tǒng)應(yīng)用于卵母細胞保存，實現(xiàn)了卵母細胞的玻璃化保存。當(dāng)實驗條件設(shè)置氮氣流速為0.8 L/min時，可產(chǎn)生最優(yōu)尺寸的液滴，直徑為(140±58) μm。結(jié)果表明，減小微滴體積能降低玻璃化保存時所需的CPAs濃度，在1.4 mol/L乙二醇、1.1 mol/L DMSO和1 mol/L蔗糖條件下，即可實現(xiàn)卵母細胞玻璃化。采用該系統(tǒng)保存卵母細胞，細胞存活率較高，且孤雌激活后分裂率達96%，囊胚率達26%。

噴射微滴玻璃化保存系統(tǒng)產(chǎn)生的微滴足夠小，將其直接噴入液氮，降溫速率可明顯提升。冷卻速率超過105℃/min，是塑料麥管冷凍速率的40倍?？擅黠@降低玻璃化保存時所需的CPAs濃度，避免了高濃度保護劑對細胞造成的滲透損傷和毒性損傷。然而，該系統(tǒng)尚存在不足之處，如R. E. Assal等[29]提出的系統(tǒng)，僅用一個直徑為8.5 cm的聚乙烯薄膜接收含紅細胞的液滴，每次能夠處理的細胞量僅為80 μL。若單次接收時間過長，則會造成微滴疊加，微滴體積的增大不利于玻璃化保存。Zhang X.等[30]采用噴射微滴玻璃化保存卵母細胞時，易造成細胞丟失。

3 生物打印微滴玻璃化保存

生物打印技術(shù)是對生物材料，如活細胞、生長因子、基因、藥物等進行打印的一種技術(shù)，可產(chǎn)生有序微滴。按驅(qū)動機制不同，可分為壓電噴墨打印、熱式打印、基于閥門打印、激光直寫打印、激光轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)打印等。現(xiàn)已成功應(yīng)用于組織三維重建、再生醫(yī)學(xué)移植和診斷、藥劑學(xué)及高通量篩選、癌癥研究等[31]多個領(lǐng)域，并已逐步拓展到醫(yī)用低溫保存領(lǐng)域。

基于生物打印技術(shù)，Xu Feng等[32]自主設(shè)計細胞打印機。該打印機以氣動壓力作為驅(qū)動機制，通過調(diào)節(jié)電磁閥開啟時間來控制微滴大小。實驗采取160滴每秒的速度對胚胎干細胞進行打印，通過合理控制液滴尺寸、細胞濃度及培養(yǎng)時間，最終形成統(tǒng)一尺寸的擬胚體。Shi Meng等[33]采用Xu Feng等[32]的打印技術(shù)，設(shè)計了一款非接觸式玻璃化裝置。該裝置由細胞室、液氮室及中間的一層150 μm超薄高導(dǎo)熱速率銀膜構(gòu)成。實驗時，先采用Xu Feng等[32]的細胞打印機，將氣動壓力設(shè)定為0.03 MPa，在細胞室形成一個8×8的均勻液滴矩陣。然后向液氮室注入液氮，利用液氮沸騰和超薄銀膜熱傳遞，即可迅速實現(xiàn)細胞玻璃化。該裝置已成功實現(xiàn)NIH3T3細胞和hASCs細胞玻璃化保存，且避免了液氮對細胞造成的潛在污染。噴墨打印是利用壓電元件驅(qū)動流體體積壓縮，儲液罐內(nèi)壓力增加，導(dǎo)致細胞懸浮液通過噴嘴噴出微滴。U. Demirci等[34-35]基于噴墨打印技術(shù)開發(fā)出新型的生物打印裝置。裝置利用脈沖激勵時間控制微滴生成，產(chǎn)生的微滴均垂直滴入下方液氮中玻璃化。凍存細胞用直徑70 μm的細胞篩收集，并迅速轉(zhuǎn)移到解凍液中解凍。結(jié)果顯示，用類似于慢速冷凍所用的低濃度低溫保護劑，1.5 mol/L丙二醇和0.5 mol/L海藻糖即可實現(xiàn)玻璃化，復(fù)溫后細胞存活率超過90%。目前，該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于多種動物細胞類型的玻璃化保存，如鼠肝細胞、3T3成纖維細胞、HL-1心肌細胞、小鼠胚胎干細胞和淋巴母細胞[34]。R. Dou等[36]同樣采用噴墨打印技術(shù)，將含有小鼠成纖維細胞3T3和人類神經(jīng)祖細胞的懸浮液，以9×9的矩陣形式打印在聚合物底板上，微滴體積約380皮升，然后轉(zhuǎn)移到溫度為293 K的冰箱內(nèi)玻璃化。用DMSO作抗凍劑對3T3細胞進行玻璃化實驗，結(jié)果顯示解凍后細胞平均活性大于90%，所需的CPAs濃度小于0.8 mol/L。與其他玻璃化保存方法相比，所需的CPAs濃度明顯降低。對人類神經(jīng)祖細胞進行玻璃化保存，復(fù)蘇后細胞活性僅55%，但與采用傳統(tǒng)方法所獲得的細胞存活率具有可比性，所需的CPAs濃度也明顯降低。

生物打印技術(shù)能迅速產(chǎn)生大小均勻的液滴，精準(zhǔn)控制液滴噴射位置和方向，具有簡單性和敏捷性。然而在低溫保存領(lǐng)域，生物打印技術(shù)的應(yīng)用仍存在挑戰(zhàn)，如生成微滴時，剪應(yīng)力、毛細管力等機械力均可能引起細胞變形；將細胞打印到接收面時，接觸面對細胞的沖擊力易造成細胞損傷等。因此，采用生物打印微滴玻璃化保存時，還需進一步優(yōu)化方案，如選擇合適的微滴產(chǎn)生機制、選擇具有生物相容性的噴頭及合理設(shè)計接收面等。

4 微流體封裝微滴玻璃化保存

微流體液滴生成技術(shù)是指將兩種不相融的流體，一種作為連續(xù)相，另一種作為分散相，將分散相以微小體積(10-15～10-9L)單元形式分散于連續(xù)相中，在表面張力與剪切力共同作用下，自發(fā)形成微滴[37]。微滴生成方式可分為被動法和主動法，被動法是通過控制微管道結(jié)構(gòu)及兩相流速來控制微滴生成；主動法是通過外場驅(qū)動力，如熱量、氣壓、壓電、微閥和磁場等，來生成微滴[38]。目前微流體技術(shù)已成功應(yīng)用于DNA、蛋白質(zhì)、酶的生化分析及細胞的篩選、病毒檢測等多個領(lǐng)域，逐步拓展到玻璃化保存領(lǐng)域。

Huang Haishui等[39]設(shè)計了一款5個入口的微流體聚焦裝置，由此制備細胞微膠囊。通道中間入口注含有細胞的懸浮液，兩側(cè)注海藻酸水溶液，利用海藻酸水溶液將細胞限制在所生成的微膠囊內(nèi)部。距聚焦口最近的兩側(cè)通氯化鈣溶液，運用瑞利-高原不穩(wěn)定性，含有細胞的懸浮液被連續(xù)流動的氯化鈣溶液封裝成微滴。在該流動條件下，形成的微滴具有高分散性，微膠囊直徑約220 μm。研究表明，少量的鈣離子能增加藻酸鹽基質(zhì)強度，有助于保持微膠囊玻璃化保存后的完整性[40]。采用該裝置封裝小鼠胚胎干細胞(mESCs)和人類脂肪干細胞(hADSCs)。于通道末端收集細胞微膠囊，然后用QMC法和OPS法玻璃化保存。結(jié)果表明，用1.5 mol/L丙二醇和0.5 mol/L海藻糖作為低溫保護劑即可實現(xiàn)玻璃化，且復(fù)溫后細胞活性大于80%。通過低溫顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)海藻酸鹽微膠囊能有效抑制復(fù)溫后反玻璃化現(xiàn)象發(fā)生。在采用微流體技術(shù)封裝細胞時，保證每個微滴中所含細胞數(shù)的均勻性是該技術(shù)的關(guān)鍵。M. Chabert等[41]設(shè)計了一種T型微流控裝置，該裝置運用純粹的動力學(xué)方法，在沒有任何外部傳感及反饋控制下，即可將細胞封裝成皮升級微滴。通道中間入口通含細胞的培養(yǎng)基，左右兩側(cè)通入油，以油作為連續(xù)相，在剪切流中可變形物體的橫向漂移和擠壓流中立體驅(qū)動分散作用下，每秒可對160個細胞進行連續(xù)封裝和排序。結(jié)果表明，封裝的微滴中僅含有一個細胞的純度為70%～80%，僅有1%的微滴可能為空液滴。J. F. Edd等[42]采用同樣的裝置對細胞進行封裝排序，并檢測細胞活性，92.9%的細胞膜保持完整性，對照組為96.2%。裝置每秒可產(chǎn)生14.9×103個皮升級液滴，明顯具有細胞封裝微滴體積小、通量高的特點。此外，在實現(xiàn)微流控芯片一體化方面，A. E. Sgro等[43]曾嘗試在微流體芯片上直接對B淋巴瘤細胞封裝冷凍。他提出在T型微通道的蛇形通道下游放置熱電制冷器，利用水溶液和不混溶油冰點差別大，通過熱電制冷器控制微流控芯片的部分溫度，直接凍結(jié)芯片上的微滴。該裝置在微流體芯片封裝微滴玻璃化保存一體化結(jié)構(gòu)設(shè)計上具有啟發(fā)性。

微流體封裝液滴玻璃化保存具有細胞封裝效率高、微滴體積小的優(yōu)點。然而，目前微流體封裝微滴玻璃化保存相關(guān)研究尚處于起步階段，仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如封裝的微滴體積可達到皮升級，易造成細胞缺氧，針對此問題，一種包含空氣供應(yīng)和多噴嘴出口的三維微流體裝置[44]正在研發(fā)中。在材質(zhì)選擇上，微流體芯片選用具有疏水性的聚二甲基硅氧烷制作，但仍面臨導(dǎo)熱受限，無法在芯片上直接實現(xiàn)玻璃化的問題。

5 總結(jié)與展望

最小體積法玻璃化保存為細胞長期有效儲存提供重要手段。本文綜述了最小體積法玻璃化保存的最新研究進展，包括有載體的微滴玻璃化保存、噴射納升級微滴玻璃化保存、生物打印微滴玻璃化保存、微流體封裝微滴玻璃化保存。其中，新型的微滴生成技術(shù)，如噴射技術(shù)、生物打印技術(shù)、微流體封裝技術(shù)，可迅速產(chǎn)生大小均勻、尺寸微小的液滴。將其與玻璃化保存相結(jié)合，有望解決高通量問題，且滿足自動化要求，將是未來最小體積法玻璃化保存的發(fā)展趨勢。