EZH2、p16啟動(dòng)子在乳腺癌亞型中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

張一兵，胡繼衛(wèi)，盧鶴翔，董桂蘭

（1.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理教研室，河北 唐山 063210；2.河北省唐山市人民醫(yī)院 乳腺科，河北 唐山 063210；3.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 形態(tài)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063001；4.河北省唐山市人民醫(yī)院 放化科，河北 唐山 063001）

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，發(fā)病率有逐年增加趨勢，預(yù)計(jì)到2021年，我國乳腺癌患者將達(dá)250萬[1]。乳腺癌是高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，根據(jù)雌激素受體（estrogen receptor, ER）、孕激素受體（progesterone receptor, PR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal receptor 2, HER-2）表達(dá)的不同，可分為Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達(dá)型和三陰型（triple negative breast cancer, TNBC）4種不同的分子亞型，每種分子亞型其生物學(xué)特征有所不同，因此其預(yù)后及治療效果有較大差異[2]。果蠅Zeste基因增強(qiáng)子同源物2（enhancer of zeste homolog 2, EZH2）是果蠅Zeste基因增強(qiáng)子人類同源物，其高表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞失控性增殖，與多個(gè)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。p16是細(xì)胞周期負(fù)向調(diào)控因子，有抑制細(xì)胞增殖作用，其表達(dá)降低可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[4]。EZH2和p16異常表達(dá)在乳腺癌中的作用多有報(bào)道，但有關(guān)其在不同分子分型乳腺癌中的表達(dá)少有報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)（簡稱免疫組化）和甲基化PCR分別檢測不同分子亞型乳腺癌中EZH2表達(dá)和p16啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，并分析與臨床病理特征的關(guān)系，探討EZH2與p16啟動(dòng)子甲基化乳腺癌分子分型及臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取20014年1月-2015年4月唐山人民醫(yī)院乳腺癌手術(shù)標(biāo)本81例。所有患者為女性，年齡38～81歲，均為首次發(fā)病，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移癌，術(shù)前沒有接受任何治療，無其他惡性腫瘤病史，患者病理分期、組織學(xué)類型判定依據(jù)2004年NCCN指南標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 材料和儀器

實(shí)驗(yàn)所需EZH2抗體及免疫組化（SP）試劑（購自北京中杉金橋生物制品有限公司）。石蠟組織DNA提取試劑盒（購自上海生工生物工程公司），DNA甲和DNA甲基化PCR試劑盒（美國Epigentek公司）。PCR擴(kuò)增儀（德國Eppendorf公司），ND2000微量核酸蛋白檢測儀（美國Thermo公司），Geldoc XR凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂公司），BX63全自動(dòng)顯微鏡掃描系統(tǒng)（日本奧林巴斯）。

1.3 免疫組化檢測乳腺癌組織EZH2蛋白表達(dá)

常規(guī)組織病理切片4μm，脫蠟至水，高壓抗原修復(fù)，采用免疫組化染色（具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行），DAB顯色，蘇木素復(fù)染，透明封固。PBS代替一抗設(shè)為空白對照。結(jié)果判定：EZH 2的免疫組化結(jié)果主要為細(xì)胞核染色，細(xì)胞核無染色計(jì)1分，染色＜25%計(jì)2分，染色在25%～75%計(jì)3分，染色≥75%計(jì)4分，3～4分為EZH 2高表達(dá)，1～2分為EZH 2低表達(dá)。

1.4 甲基化PCR檢測乳腺癌組織p16啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

石蠟組織4 μm厚度連續(xù)切片，取3～5片，根據(jù)試劑盒說明書提取基因組DNA，檢測水平核純度后，亞硫酸氫鈉修飾DNA，若啟動(dòng)子發(fā)生甲基化，修飾后甲基化胞嘧啶維持不變（Cm），若啟動(dòng)子未發(fā)生甲基化，DNA修飾后胞嘧啶（C）變?yōu)槟蜞奏ぃ║），修飾后的DNA進(jìn)行甲基化PCR；p16啟動(dòng)子甲基化特異性引物：正向5'-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATC GC-3'， 反 向 5'-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3'，65℃退火，擴(kuò)增片段150 bp；p16啟動(dòng)子非甲基化特異性引物為：正向5'-TTATTAGAGGGTGGGGTGGAT TGT-3'，反向 5'-CAACCCCAAACCACAACCATAA-3'，60℃退火，擴(kuò)增片段151 bp。加入反應(yīng)體系后，95℃預(yù)變性5 min，然后95℃延伸30 s，相應(yīng)退火溫度45 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳，gelgreen染色后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察成像記錄結(jié)果，如出現(xiàn)150 bp產(chǎn)物則為p16基因啟動(dòng)子發(fā)生了甲基化，如出現(xiàn)151 bp產(chǎn)物，則認(rèn)為p16基因啟動(dòng)子未發(fā)生甲基化。

1.5 乳腺癌分子分型

ER、PR和HER-2的診斷主要基于免疫組化檢測。ER 和 PR（-）定義為陰性，ER 和 PR（+）、（++）、（+++）定義為陽性；HER-2免疫組化結(jié)果顯示（-～++）定義為陰性，（+++）定義為陽性。根據(jù)ER、PR和HER-2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將乳腺癌分為：Luminal A型：ER和（或）PR陽性、HER-2陰性；Luminal B型：ER和（或）PR陽性、HER-2陽性；HER-2過表達(dá)型：ER、PR 均陰性，HER-2陽性；三陰型：ER、PR、HER-2均陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用IBM Statistics 22統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)分析用Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分子分型構(gòu)成

81例乳腺癌患者中，22例為Luminal A（27.1%）；25例為Luminal B型（30.8%）；10例為HER-2過表達(dá)型（12.3%）；24例為TNBC（29.6%）。

2.2 EZH 2表達(dá)與乳腺癌分子分型的關(guān)系

所有乳腺癌患者中，EZH2陽性表達(dá)率為49.3%（40/81），Luminal A、Luminal B、HER-2和TNBC 患者，EZH2陽性表達(dá)率分別為36.4%（8/22）、36%（9/25）、60%（6/10）和 70.8%（17/24），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 乳腺癌患者不同分子亞型EZH2表達(dá)陽性率的比較例（%）

圖1 EZH2在乳腺癌分子亞型的表達(dá) （SP×200）

2.3 p16啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與乳腺癌分子分型的關(guān)系

所有乳腺癌患者中，p16啟動(dòng)子甲基化率37%（30/81），Luminal A、Luminal B、HER-2、TNBC 患者中，p16啟動(dòng)子甲基化率分別為27.2%（6/22）、28%（7/25）、40%（4/10）和54.2%（13/24），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 2和圖 2。

表2 乳腺癌患者不同分子亞型p16基因啟動(dòng)子甲基化的比較 例（%）

圖2 不同分子亞型p16基因甲基化狀態(tài)（MSP）

2.4 EZH2表達(dá)和p16啟動(dòng)子甲基化與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

EZH2表達(dá)與患者組織分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER受體表達(dá)狀況有關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡、PR和HER-2受體表達(dá)無關(guān)（P＞0.05）；p16啟動(dòng)子甲基化與腫瘤組織分級、臨床分期有關(guān)（P＜0.05），與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PR、ER和HER-2受體表達(dá)無關(guān)（P＞0.05）。見表 3。

表3 EZH2表達(dá)和p16啟動(dòng)子甲基化與乳腺癌臨床特征關(guān)系 例（%）

2.5 EZH2表達(dá)和p16啟動(dòng)子甲基化相關(guān)性

EZH2表達(dá)陽性的乳腺癌患者中，p16啟動(dòng)子甲基化率為52.5%（21/40），EZH2表達(dá)陰性患者為21.9%（9/41），相關(guān)分析顯示兩者正相關(guān)（r=0.276）。見表4。

表4 EZH2表達(dá)和p16啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的關(guān)系 例（%）

3 討論

乳腺癌分子分型中以Luminal型最為常見，郝卓芳等[5]報(bào)道441例乳腺癌組織中Luminal型（Luminal A+Luminal B）占67.3%A，HER-2過表達(dá)型和TNBC型分別占13.8%和19%。本研究也證實(shí)乳腺癌患者分子分型中以Luminal型最多，Luminal A、Luminal B、HER-2過表達(dá)、TNBC患者所占比例分別為27.1%、30.8%、12.3%和29.6%。不同分子分型的乳腺癌由于基因型的差異而導(dǎo)致乳腺癌組織表型表現(xiàn)不同，同樣的治療方案療效不一，預(yù)后也截然不同。鮑萍萍等[6]研究顯示管腔型乳腺癌預(yù)后較好，三陰性和HER-2過表達(dá)型乳腺癌預(yù)后則較差。楊海玉等[7]報(bào)道luminal型對內(nèi)分泌治療比較敏感；HER-2過表達(dá)型對赫賽汀靶向治療敏感；而三陰型乳腺癌對內(nèi)分泌治療和分子靶向治療都缺乏敏感性。由于TNBC治療選擇少，不能接受針對ER和PR陽性的內(nèi)分泌治療，也不能接受針對HER-2陽性的靶向治療，因此受到研究人員的廣泛重視。

EZH2是一個(gè)癌基因，其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。文獻(xiàn)報(bào)道[8]EZH2高表達(dá)的正常乳腺上皮組織癌變的風(fēng)險(xiǎn)增加，其中ER陰性的乳腺上皮組織乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加4倍。INARI等[9]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移灶中EZH2高表達(dá)的乳腺癌患者手術(shù)后容易復(fù)發(fā)，預(yù)后不良。還有文獻(xiàn)[10]報(bào)道接受三苯氧胺內(nèi)分泌治療的乳腺癌患者中，EZH2陽性患者臨床緩解率要低于EZH2陰性者。本實(shí)驗(yàn)顯示在高組織分級、高臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER陰性的腫瘤患者中，EZH2呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。不同分子分型的乳腺癌組織中TNBC組陽性表達(dá)率最高，有差異，與李杰寶等研究結(jié)果不一致[11]。本研究結(jié)果提示，EZH2表達(dá)增加對乳腺癌患者內(nèi)分泌治療的效果和預(yù)后產(chǎn)生不良影響，被認(rèn)為是判斷乳腺癌預(yù)后的重要指標(biāo)。EZH2高表達(dá)可能是TNBC對內(nèi)分泌治療不敏感原因之一，對評估內(nèi)分泌治療療效有一定臨床意義。

p16基因是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，可抑制CDK4/6蛋白對pRb的磷酸化水平，保持pRb的去磷酸化狀態(tài)以抑制細(xì)胞周期調(diào)控因子E2F的活性，阻遏細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞增殖[4]。p16基因甲基化導(dǎo)致其活性降低，促進(jìn)細(xì)胞增殖，具有致癌作用。關(guān)于p16基因甲基化在乳腺癌的作用目前還有爭議，AAKARI等[12]認(rèn)為p16甲基化參與乳腺癌進(jìn)展，而SHENG等[13]研究顯示p16基因表達(dá)異常與乳腺癌的預(yù)后沒有關(guān)聯(lián)。本研究顯示高臨床分期、高組織分級的乳腺癌組織中，p16基因甲基化率增高，提示p16甲基化削弱p16抑癌作用，促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。但不同分子分型的乳腺癌組織中p16甲基化率無差異，一方面可能與筆者納入研究的病例數(shù)少有關(guān)，另一方面可能由于乳腺癌的高異質(zhì)性，不同分子亞型中p16甲基化與其他因子調(diào)控有關(guān)。

本研究中筆者進(jìn)一步分析EZH2表達(dá)與p16甲基化的關(guān)系，結(jié)果顯示兩者之間呈現(xiàn)正相關(guān)，提示在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中兩者可能存在協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)EZH2的組蛋白甲基化是引起抑癌基因沉默的一種潛在機(jī)制。EZH2蛋白具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，催化核小體H3組蛋白第27位賴氨酸（H3K27）發(fā)生三甲基化（H3K27me3），甲基化后的H3K27me3募集PRC2復(fù)合物到特定的基因位點(diǎn)，進(jìn)而沉默靶基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[14]。PURKAIT等[15]研究發(fā)現(xiàn)，CDKN2A基因未缺失的腦膠質(zhì)瘤中，EZH2的高表達(dá)可導(dǎo)致p16的表達(dá)缺失。UEDA等[14]在白血病研究中也發(fā)現(xiàn)，抑制劑DNze沉默EZH2表達(dá)可以導(dǎo)致p16表達(dá)上調(diào)，抑制腫瘤干細(xì)胞增殖，而敲除p16基因則削弱DNze的治療效果，染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)EZH2被募集在p16基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，誘導(dǎo)H3K27三甲基化發(fā)生，進(jìn)而抑制p16基因表達(dá)。為此，筆者推測在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，EZH2可能通過p16甲基化促進(jìn)腫瘤進(jìn)展過程。

綜上所述，EZH2表達(dá)增加是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要原因，而且多見于惡性程度更高的TNBC患者。p16基因甲基化失活是EZH2作用機(jī)制之一。EZH2作為乳腺癌患者內(nèi)分泌治療效果評估和預(yù)后反應(yīng)的一個(gè)指標(biāo)，有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。但在不同分子分型的乳腺癌組織中，p16基因啟動(dòng)子甲基化差異不顯著，這可能是由于乳腺癌的異質(zhì)性，不同分子亞型中p16基因甲基化調(diào)控復(fù)雜多樣所致。本研究中，筆者只在組織水平檢測EZH2和p16甲基化與乳腺癌分子分型的關(guān)系，詳細(xì)的分子機(jī)制還有待在細(xì)胞分析水平進(jìn)一步的研究。