膀胱癌組織黑色素瘤抗原-A3的表達及其對核因子Kappa B信號通路的影響*

周高峰，黃智紅，呂磊，向威，孫瑩，朱金燕，袁敬東，章傳華，吳維

（湖北省武漢市第一醫(yī)院 1.泌尿外科，2.血液內(nèi)科，湖北 武漢 430022）

膀胱癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度居泌尿系統(tǒng)第2位[1]。研究表明[2-3]，泌尿道持續(xù)感染癥狀與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，炎癥細胞及其分泌的炎癥因子可使腫瘤微環(huán)境發(fā)生變化，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、移行和分化等生物學行為。黑色素瘤抗原 A3（melanoma-associated antigen-A3, MAGE-A3）是一種具有顯著組織表達限制性的腫瘤抗原，文獻報道MAGE-A3與多種腫瘤的大小、臨床分期及復發(fā)轉(zhuǎn)移等正相關，提示MAGE-A3通過某種方式參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。核因子kappa B（nuclear factor kappa B,NF-κB）是介導炎癥及免疫反應的中心物質(zhì)。本研究以膀胱癌患者為研究對象，探討MAGE-A3是否通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)腫瘤細胞的炎癥微環(huán)境，進而參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展，為膀胱癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013年6月1日-2016年5月31日在武漢市第一醫(yī)院泌尿外科初次診斷或初次接受治療的膀胱癌患者120例。取術中切取的膀胱癌組織（膀胱癌組）和正常膀胱組織（遠離腫瘤邊緣＞3 cm的正常膀胱組織作為對照組）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準，所有患者知情同意并簽署知情同意書。手術切除的組織立即置于液氮中，并置入-80℃冰箱冷凍保存。

納入標準：①既往無其他惡性腫瘤病史；②術前未經(jīng)放化療或其他方式治療；③冷凍切片和病理檢查確診為膀胱癌；④臨床資料和隨訪資料完整。排除標準：①合并嚴重的心肺功能障礙不宜手術者；②合并一種或幾種自身免疫性疾??；③嚴重肝腎功能障礙或不能控制的高血壓、高血糖；④妊娠。

1.2 主要儀器和試劑

實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR）儀（美國Thermo Fisher公司），電泳儀（美國Bio-Rad公司），電轉(zhuǎn)儀（美國Bio-Rad公司），凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司），普通PCR儀（美國Bio-Rad公司），水平搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），高速離心機（德國Eppendorf公司），酶標儀（美國BioTek公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（以色列Biological Industries公司），Trizol（美國 Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Fisher公司），熒光定量試劑盒（德國QIAGEN公司），全蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），anti-MAGE-A3、anti-p65及 anti-p-p65（美國 Abcam 公司），HRP標記二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司），電化學發(fā)光（Electrochemiluminescence, ECL）液（美國Thermo Fisher公司），腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNF-α）和白介素1β（interleukin 1β, IL-1β） ELISA試劑盒（美國Abcam公司），所有引物（北京六合華大基因科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測MAGE-A3 mRNA的表達水平 在Ensemble網(wǎng)站查詢?nèi)薓AGE-A3和管家基因GAPDH的編碼序列，采用Primer Premier 5.0軟件設計引物，序列如下，MAGE-A3引物：正向5'-GTCGTCGG AAATTGGCAGTAT-3'，反向5'-TGGGGTCCACTTCCA TCAG-3'；GAPDH引物：正向5'-GGAGCGAGATCCCT CCAAAAT-3'，反向 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATG G-3'。Trizol法提取膀胱癌組織和正常組織的總RNA，采用DNA酶（DNase）處理去除DNA后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，MAGE-A3和GAPDH特異性引物進行qRT-PCR。反應體系如下：ddH2O 8.9 μl，正反向引物各0.8 μl，SYBR Green 12.5 μl，cDNA 2 μl， 共 25 μl。 采 用兩步法進行擴增反應。反應條件如下：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，57℃退火30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH管家基因為內(nèi)參，根據(jù)目的基因的相對表達量 =2-△△Ct計算結(jié)果。

1.3.2 Western blot檢測MAGE-A3蛋白的表達水平及p65磷酸化水平 秤取約50 mg組織并加入預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS），使用勻漿器將組織樣品勻漿并加入適量RIPA buffer裂解組織，4℃，12 000 r/min離心取上清即得總蛋白。按體積比總蛋白：5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate, SDS）loading buffe=4∶1混勻后99℃持續(xù)加熱5 min，置于冰上待樣品冷卻后即可進行上樣電泳。電泳結(jié)束后切膠并制備轉(zhuǎn)移“三明治”結(jié)構(gòu)，恒壓30 V濕轉(zhuǎn)過夜。5% BSA室溫封閉1 h，一抗室溫孵育1 h，磷酸鹽緩沖液-吐溫（phosphate buffered salinetween, PBST）漂洗3次，每次5 min，二抗室溫孵育30 min，PBST漂洗3次，每次5 min。ECL發(fā)光液進行化學發(fā)光采集圖像并進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3 ELISA檢測膀胱癌組織和正常膀胱組織中TNF-α和IL-1β的含量 取適量膀胱癌組織和正常膀胱組織，加入預冷的PBS勻漿，4℃，5 000 r/min離心去除上清。加入適量PBS重懸沉淀，冰上超聲裂解細胞，再次離心后取上清置于冰上備用。按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟進行操作：①標準品的稀釋；②加樣：分別設置空白孔（空白孔不加任何樣品及酶標試劑，其余各步驟操作與待測樣品孔相同）和待測樣品孔；③加酶標抗體，37℃溫箱孵育30 min；④配洗滌液，洗滌各反應孔5次，每次1 min；⑤加底物，37℃溫箱孵育30 min；⑥洗滌各反應孔5次，每次1 min；⑦加試劑顯色；⑧加終止液終止反應；⑨測定：以空白孔調(diào)零，用酶標儀在相應波長下測定吸光度（OD值），通過繪制標準曲線計算樣品中TNF-α和IL-1β的含量。

1.3.4 細胞培養(yǎng) 膀胱癌細胞系T24來源于美國模式培養(yǎng)物保藏所（American type culture collection, ATCC）細胞庫，以含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%二氧化碳CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.3.5 小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）敲減MAGE-A3的表達水平 購買MAGE-A3 siRNA，采用脂質(zhì)體（LipofectamineTM2000）（以下簡稱LipoTM2000）轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1天，將T24細胞接種于6孔板中，約1×106個/孔，融合度約80%。實驗前溫育適量不含血清的優(yōu)化培養(yǎng)基（以下簡稱Opti-MEM）。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：①稀釋轉(zhuǎn)染試劑LipoTM2000：取適量LipoTM2000和250 μl Opti-MEM混勻，室溫孵育5 min；②稀釋siRNA：取250 μl Opti-MEM和siRNA，混勻；③稀釋后的LipoTM2000與稀釋后的siRNA混合，即①和②混合并混勻，室溫孵育10 min以形成siRNA-LipoTM2000復合物；④將siRNA-LipoTM2000混合液逐滴滴入培養(yǎng)液中，輕輕搖晃，使之混勻；⑤37℃培養(yǎng)4～6 h后，除去舊培養(yǎng)基，更換新鮮的生長培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織中總體MAGE-A3 mRNA和蛋白及炎癥因子的表達變化

膀胱癌組織與正常膀胱組織中MAGE-A3 mRNA、蛋白及炎癥因子的表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（MAGE-A3 mRNA：t=6.664，P=0.000；MAGE-A3蛋白：t=5.877，P=0.000；TNF-α ：t=27.09，P=0.000；IL-1β ：t=37.45，P=0.000），膀胱癌組織中 MAGE-A3 mRNA、蛋白和炎癥因子含量高于正常膀胱組織，見表1和圖1。

2.2 MAGE-A3陽性患者炎癥因子與膀胱癌分期的關系

120例患者中MAGE陽性56例，陽性率為46.7%。相關性分析結(jié)果顯示，MAGE-A3陽性率和患者膀胱癌組織中炎癥因子的含量與一般臨床資料無相關，而與膀胱癌分期正相關。見表2、3。

2.3 敲減MAGE-A3對NF-κB P65磷酸化及炎癥因子表達的影響

siRNA敲減MAGE-A3的表達并驗證（見圖2A），siMAGE-A3組與siCtrl組比較，差異有統(tǒng)計學意義（siMAGE-A3 mRNA：t=14.270，P=0.000；p-p65：t=5.817，P=0.000；TNF-α：t=3.252，P=0.017；IL-1β ：t=3.026，P=0.029）siMAGE-A3組NF-κB P65磷酸化水平及TNF-α和IL-1β的表達水平均降低，見圖2B、C、D、E。

表1 膀胱癌組織和正常膀胱組織中炎癥因子的表達變化（ng/L，±s）

表1 膀胱癌組織和正常膀胱組織中炎癥因子的表達變化（ng/L，±s）

組別 TNF-α IL-1β正常膀胱組 89.1±12.6 84.2±15.8膀胱癌組 552.4±186.9 699.5±179.3 t值 27.090 37.450 P值 0.000 0.000

圖1 兩組MAGE-A3 mRNA和蛋白表達比較

表2 膀胱癌患者不同影響因素的MAGE-A3陽性率的比較

表3 患者腫瘤組織中炎癥因子與臨床病理特征的關系分析 （ng/L，±s）

表3 患者腫瘤組織中炎癥因子與臨床病理特征的關系分析 （ng/L，±s）

因素 例數(shù) TNF-α t值 P值 IL-1β t值 P值年齡≥50歲 90 547.9±167.1 0.492 0.624 697.3±177.6 0.228 0.820＜50 歲 30 565.9±192.6 706.1±199.5性別男92 549.2±185.6 0.347 0.729 689.8±201.3 0.992 0.323女28 562.9±173.2 731.4±168.9組織類型透明細胞癌 90 540.5±197.4686.7±211.5 1.215 0.227其他類型癌 30 588.1±169.3 737.9±159.4 1.183 0.239

續(xù)表3

圖2 MAGE-A3調(diào)控NF-κB P65磷酸化

3 討論

膀胱癌是最常見的惡性腫瘤之一[6]，男性發(fā)病率高于女性居第4位，且其世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率有升高趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌的存活率與適應性免疫反應相關基因的表達水平最相關?？ń槊绻嘧⑹悄壳肮J的預防膀胱癌術后復發(fā)的最好策略，其作用機制是激活膀胱黏膜的非特異性抗腫瘤細胞免疫反應，但嚴重的副反應限制卡介苗的應用。因此，尋求一種能夠有效激活機體免疫反應殺傷腫瘤細胞而無明顯副作用的藥物或靶點成為當前亟待解決的問題。

MAGE-A3為MAGE家族成員，除表達于大部分的黑色素瘤外，還廣泛表達于其他多種組織類型腫瘤如肺癌、胃癌、肝細胞癌和結(jié)直腸癌等，但不表達于除睪丸和胎盤外的正常組織細胞[7]，是腫瘤特異性的共同抗原，因而MAGE-A3被認為是腫瘤特異性免疫治療的理想免疫原[8]。已有臨床試驗證明將MAGE抗原肽接種至表達MAGE-A3和HLA-A1分子的黑色素瘤患者體內(nèi)，部分患者腫瘤縮小甚至消失[9]。文獻報道，從人膀胱癌細胞系SW780中分離出的腫瘤干細胞樣細胞MAGE-A3呈高表達狀態(tài)[10]；尿道腫瘤組織中MAGE-A3亦呈高表達狀態(tài)[11]；膀胱移行細胞癌中MAGE-A3基因有較高表達，但癌旁組織無表達[12]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中MAGE-A3 mRNA、蛋白及炎癥因子的表達水平高于正常膀胱組織，且與膀胱癌分期正相關，與文獻報道一致。

慢性炎癥與癌癥的發(fā)生存在密切關系，炎癥細胞對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有強大的影響。在腫瘤發(fā)生早期，炎細胞是其有力的啟動因子，促進細胞基因組不穩(wěn)定和血管發(fā)生，炎癥細胞及其產(chǎn)生的趨化因子和細胞因子可調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、移行和分化[13]。研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌關聯(lián)巨噬細胞產(chǎn)生的MCP-1和VEGF在膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的促進作用[14]。NF-κB信號通路激活是炎癥誘導的致癌作用的典型代表，文獻報道淋巴毒素β受體激活可促進原癌基因Re1A的表達及NF-κB信號通路炎癥因子TNFα和IL-1β的上調(diào)，進而改變腫瘤的炎癥微環(huán)境，促進膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展[15]。由中性粒細胞與淋巴細胞的比例（neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR）評估的炎癥水平與尿路上皮腫瘤患者的預后密切相關，低NLR的患者的生存率提高4倍[16]。以上文獻提示，炎癥與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展及預后均有密切關系。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中炎癥因子的表達水平高于正常膀胱組織，膀胱癌分期呈正相關性。MAGE-A3是否通過炎癥通路參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，NF-κB p65磷酸化水平及TNF-α和IL-1β的表達水平均降低，提示MAGE-A3可能通過炎癥通路參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，MAGE-A3可能通過NF-κB信號通路調(diào)控膀胱癌細胞炎癥狀態(tài)，促進膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展，且與膀胱癌分期密切相關。