青海省不同生態(tài)區(qū)蠶豆根瘤菌16S rDNA分析

張小娟

(青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院,省部共建三江源生態(tài)與農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

蠶豆不僅是一種重要的糧食作物，同時(shí)也是蔬菜、飼料和綠肥。蠶豆作為糧食作物，可為人體提供所必須的蛋白質(zhì)和其它各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；蠶豆的根瘤較其它作物大而且多，因此蠶豆享有“生物固氮之王”的美譽(yù)[1-2]。蠶豆與禾本科其它作物套種可帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益，是“綠色農(nóng)業(yè)”中重要的養(yǎng)地作物。根瘤菌與豆科植物的共生固氮體系是生物固氮中效率最高的體系，約占生物固氮總量的65%。該體系具有固氮能力強(qiáng)、固氮量大、抗逆能力強(qiáng)等特點(diǎn)，可以提高土壤肥力，對(duì)可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義[3-7]。蠶豆根瘤菌共生體系是這一體系的成員之一，對(duì)其進(jìn)行廣泛和深入的研究，可以加強(qiáng)對(duì)共生固氮的認(rèn)識(shí)。目前國(guó)際上對(duì)蠶豆根瘤菌有不少的研究，但是對(duì)同一品種不同區(qū)域共生的根瘤菌研究較少[8-10]。本研究采用16S rDNA全序列分析的方法對(duì)青蠶14號(hào)蠶豆品種在不同生態(tài)區(qū)的根瘤菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究。鑒定篩選共生緊密的根瘤菌為蠶豆根瘤菌的配型及根瘤菌菌劑生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 6-7月在青蠶14號(hào)生長(zhǎng)地區(qū)進(jìn)行采樣，本研究選擇青海省湟中縣攔隆口鎮(zhèn)及海子溝鄉(xiāng)、共和縣鐵蓋鄉(xiāng)、樂(lè)都縣蒲臺(tái)鄉(xiāng)、互助縣臺(tái)子鄉(xiāng)和西寧市為青蠶14號(hào)根瘤菌采樣地，這6個(gè)地區(qū)為青蠶14號(hào)主要栽培區(qū)，地理特征上屬于半干旱地區(qū)，光照充沛，氣候干燥。除互助縣臺(tái)子鄉(xiāng)和樂(lè)都縣蒲臺(tái)鄉(xiāng)為水澆地外，其余5個(gè)地區(qū)均為旱地。采集植株高大，根系發(fā)達(dá)，根瘤較多且根瘤顏色鮮艷、形狀飽滿(mǎn)，體積較大的蠶豆樣本。將蠶豆的根部裝入樣本袋中(不要去掉泥土)，標(biāo)注好日期地點(diǎn)。-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩２蓸拥貐^(qū)、經(jīng)緯度及采集的根瘤菌形狀見(jiàn)表1。

表1 供試菌株Table 1 The tested strains

1.1.2 引物 PCR引物選用根瘤菌16S rDNA通用引物。擴(kuò)增引物序列：P1：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3’;P2：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC’-3。

1.2 方法

1.2.1 蠶豆根瘤菌的分離和純化 將冰箱中的備用蠶豆樣本取出，用鑷子將根上的根瘤小心剝下，用自來(lái)水沖掉泥土，用蒸餾水洗凈并裝入離心管。向離心管中加水至沒(méi)過(guò)根瘤，浸泡1 h以上，使根瘤充分吸水膨脹。在超凈工作臺(tái)中，用95%乙醇浸泡1 min，隨即75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗一次，5%次氯酸鈉浸泡5 min，無(wú)菌水沖洗10次。將表面消毒的根瘤在研缽中碾碎，并加入適量無(wú)菌水，攪拌均勻。平板涂布法接入YMA培養(yǎng)基中。28℃培養(yǎng)2～3 d。純化方法采用平板連續(xù)劃線(xiàn)法。將長(zhǎng)出的根瘤菌用接種環(huán)挑出，在YMA平板上連續(xù)劃線(xiàn)，培養(yǎng)3～5 d長(zhǎng)出單菌落。

1.2.2 蠶豆根瘤菌基因組DNA的提取 基因組DNA的提取采用BioSpin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒?；蚪MDNA檢測(cè)：取 2.5 μl PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與 2.5 μl溴酚蘭混合點(diǎn)樣，0.8%瓊脂糖凝膠水平電泳，在120 V條件下電泳30 min。凝膠電泳成像系統(tǒng)下拍照觀察。

1.2.3 蠶豆根瘤菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增在Model MG96+基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系(10 μl)：Mix 7 μl，模板DNA 1 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 5 min，94℃變性30 s，50℃復(fù)性45 s，72℃延伸1.5 min， 36 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后,在反應(yīng)混合物中加入5 μl溴酚藍(lán),混勻。取7 μl點(diǎn)入含0.5 μg·ml-1溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中,于1×TAE電泳緩沖液中、100 V電場(chǎng)下電泳90 min, 凝膠電泳成像系統(tǒng)下拍照觀察。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收：回收采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))。

1.2.4 根瘤菌16S rDNA全序列測(cè)定 用于測(cè)序的菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后直接測(cè)序，由上海生工生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。從GenBank中獲取參比菌株的16S rDNA 序列，數(shù)據(jù)經(jīng)編輯后應(yīng)用MEGA 6進(jìn)行比對(duì)，并利用Neighbor-Joining法構(gòu)建供試菌株與參比菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆根瘤菌的篩選及基因組DNA電泳結(jié)果及16 S rDNA的擴(kuò)增

首先對(duì)采取的根瘤菌樣本進(jìn)行篩選，從中獲得了6個(gè)菌株，即CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6。對(duì)這6株根瘤菌提取基因組DNA并進(jìn)行檢測(cè)(圖1)，結(jié)果顯示其DNA大小均在20 kb左右，電泳條帶整齊完整，無(wú)雜質(zhì)和RNA污染，可滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。利用根瘤菌16S rDNA通用引物對(duì)篩選的6個(gè)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2)。

2.2 供試菌株與各參比菌株之間16 S rDNA基因全序列的相似性

獲得的測(cè)序結(jié)果，利用DNAstar進(jìn)行編輯，在 GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nib.gov/)比對(duì)，從中獲得參比菌株序列，應(yīng)用MEGA6進(jìn)行比對(duì)，并利用 Neighbor-Joining法構(gòu)建供試菌株與參比菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1. CD1; 2. CD2; 3. CD3; 4. CD4; 5. CD5; 6. CD6圖1 根瘤菌基因組DNA電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis of rhizobium genomic DNA

1. CD1; 2. CD2; 3. CD3; 4. CD4; 5. CD5; 6. CD6圖2 根瘤菌16S rDNA PCR擴(kuò)增圖譜Fig.2 16S rDNA PCR products of rhizobiums

將6個(gè)供試菌株進(jìn)行擴(kuò)增回收后測(cè)序，將序列與NCBI中已報(bào)道的序列進(jìn)行相似性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果如表2。供試6個(gè)蠶豆根瘤菌菌株分屬5個(gè)不同系統(tǒng)發(fā)育分支。其中供試菌株CD4與KF008225.1相似度最高，達(dá)到98%，其余均在95%～96%之間。說(shuō)明同一品種不同區(qū)域共生菌株不相同。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

利用MEGA 6.0對(duì)供試菌種進(jìn)行Clustal比對(duì)之后(圖3)，與參比菌種進(jìn)行聚類(lèi)分析構(gòu)建參比菌株與供試菌株的N-J樹(shù)，從圖4可以看出CD1和CD2共屬同一菌屬，即節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)，CD3屬于分枝桿菌屬(Mycobacterium)，CD4和CD5屬于快生根瘤菌屬(Rhizobium)，CD6屬于中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)。來(lái)自不同地區(qū)的根瘤菌顯示出很大差異，說(shuō)明青海省不同生態(tài)區(qū)根瘤菌種類(lèi)比較豐富。具體的分類(lèi)地位還需要進(jìn)一步研究。

3 討 論

本研究通過(guò)同一品種不同生態(tài)區(qū)6個(gè)菌株16S rDNA全序列數(shù)據(jù)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示位于5個(gè)系統(tǒng)發(fā)育分支上。CD1、 CD2同屬一個(gè)類(lèi)群節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)，CD4、CD5同屬一個(gè)類(lèi)群快生根瘤菌屬(Rhizobium)，CD3，CD6分別屬于分枝桿菌屬(Mycobacterium)和中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)。4個(gè)類(lèi)群親緣關(guān)系較近。

表2 供試菌株與各參比菌株之間16S rDNA全序列的相似性分析Table 2 Similarity between strains in 16S rDNA sequence

圖3 供試菌種序列比對(duì)Figure 3 Clustal alignment between tested strains and the reported cultures

圖4 供試菌種與參比菌種系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogentic tree based on aignment of the known cultures and tested strains

同一寄主在不同環(huán)境條件下共生了不同的菌種，說(shuō)明青海不同區(qū)域有著不同的根瘤菌，其遺傳多樣性比較豐富。目前16S rDNA全序列分析是較為普遍及準(zhǔn)確的確定根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育研究的方法，一般來(lái)說(shuō)，菌種相似度在95% 以上可以認(rèn)為是同一個(gè)種，但是在本研究進(jìn)行過(guò)程中發(fā)現(xiàn)相似度最高的菌種有時(shí)并不是根瘤菌屬，而其他文獻(xiàn)對(duì)此現(xiàn)象也有報(bào)道[4]。因此在確定其分類(lèi)地位時(shí)還要結(jié)合DNA同源性分析來(lái)決定[9]。

對(duì)于青海省蠶豆根瘤菌的研究目前還比較少，本研究分離出來(lái)的根瘤菌品種與之前報(bào)道過(guò)的存在較大差異，對(duì)于青海省蠶豆根瘤菌確切的種類(lèi)及系統(tǒng)發(fā)育研究還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣品數(shù)量，收集更多代表性菌株，擴(kuò)大多樣性。

環(huán)境條件對(duì)根瘤菌有著深刻影響，包括對(duì)根瘤菌的直接影響和通過(guò)影響宿主植物間接地影響根瘤菌的遺傳多樣性區(qū)域環(huán)境條件的改變，既影響著宿主植物的生長(zhǎng)，也改變了根瘤菌的生長(zhǎng)條件，造成根瘤菌種群變化和數(shù)量的增減，因而在同一環(huán)境中出現(xiàn)了根瘤菌表型和遺傳型的多樣性。

在本研究中，從各地區(qū)分離的蠶豆根瘤菌無(wú)論是表型分析還是遺傳型分析都沒(méi)有按照地理來(lái)源進(jìn)行聚群、根瘤菌與豆科植物共生關(guān)系的建立是細(xì)菌、植物及環(huán)境三方相互作用的結(jié)果，只有適應(yīng)當(dāng)?shù)氐耐寥罈l件且又有高效固氮及競(jìng)爭(zhēng)能力的豆科植物根瘤菌共生體才能在該地發(fā)揮應(yīng)有的作用。