廣東省鵝細(xì)小病毒的分離及序列分析

黃冠雄，許丹寧，楊舒展，郭斯璇，曾依翎，黃運茂，田允波，曹 楠

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院/廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州 510225；2.廣東省出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東 廣州 510623）

鵝細(xì)小病毒（goose parvovirus，GPV）是鵝和番鴨的主要病原體，對雛鵝和雛番鴨有高發(fā)病率和高死亡率［1］。 GPV屬于單鏈線性DNA病毒，具有約5 100個核苷酸，含兩個主要開放閱讀框（ORF）和末端重復(fù)序列（ITR），左側(cè)的ORF編碼主要參與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的非結(jié)構(gòu)蛋白，另一個ORF編碼包含VP1、VP2和VP3的衣殼蛋白，3種蛋白具有相同的C端。VP蛋白是GPV的主要免疫保護(hù)性抗原，可誘導(dǎo)水禽產(chǎn)生中和抗體［2-3］。正常情況下，由于GPV的VP基因保守性高，預(yù)防和控制GPV的主要途徑是接種疫苗［4-5］。日本［6］、英國［7］、匈牙利［8］、瑞典［9］、法國［10］和美國［11］等國家相繼報道了鵝細(xì)小病毒的發(fā)生。我國主要的水禽養(yǎng)殖地區(qū)，如福建［12］、江蘇［13］、四川［14］和山東［15］等也有越來越多鵝細(xì)小病毒暴發(fā)的報道。

近年來，隨著水禽養(yǎng)殖行業(yè)的不斷發(fā)展，GPV在廣東省的病例也越來越多。然而，廣東省已有10年沒有針對GPV進(jìn)行系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查，無法掌握廣東省GPV流行毒株是否發(fā)生變異，也不清楚現(xiàn)有的GPV疫苗是否能誘導(dǎo)鵝和番鴨產(chǎn)生中和目前存在的GPV的抗體。鑒于此，我們從廣東省鵝和番鴨養(yǎng)殖場中收集病料并分離病毒，分析了GPV的VP基因，以研究廣東地區(qū)2016—2017年GPV的流行和變異情況。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在廣東省鵝主要養(yǎng)殖區(qū)收集被GPV感染的鵝的肝臟。通過瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行病毒抗原檢測。

1.2 病毒分離

使用Hanks緩沖液制備混合的肝臟勻漿，凍結(jié)3次，然后以10 000 r/min離心10 min。使用注射器通過0.22 μm過濾器過濾后，將每個胚胎的0.2 mL懸浮液接種到9日齡GPV陰性鵝胚尿囊腔中。每天檢查接種鵝胚存活，如果胚胎存活，則在接種后第6天收集尿囊液并匯集一起，用于接種無GPV的鵝胚胎以進(jìn)一步傳代；如果胚胎死亡，則通過瓊脂擴(kuò)散法測試尿囊液和內(nèi)臟器官的鵝細(xì)小病毒抗原。

1.3 PCR檢測及VP基因擴(kuò)增

按照病毒DNA提取試劑盒（Omega）說明書提取細(xì)小病毒DNA，應(yīng)用特異鑒別引物鑒別GPV后擴(kuò)增VP基因，引物如表1所示。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s、54℃30 s、72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，使用PCR純化試劑盒（Omega）純化PCR產(chǎn)物，然后送至英濰捷基公司進(jìn)行測序。

1.4 氨基酸差異分析

為了確定2個分離的GPV與其他水禽細(xì)小病毒之間的序列關(guān)系，將獲得的序列與GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中的條目進(jìn)行比較。使用MEGA v5.05程序通過Clustal W方法比對核苷酸序列。

表1 GPV鑒別引物和VP基因擴(kuò)增引物

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

為了比對和分析序列，從GenBank數(shù)據(jù)庫下載了多個具有代表性的GPV序列。使用Lasergene 7.1（DNASTAR，Madison，Wisconsin，USA）編輯和分析全基因序列。采用遺傳分析軟件MEGA 5.05用ML方法繪制VP基因發(fā)育進(jìn)化樹。

1.6 正負(fù)選擇地點的估計和選擇壓力

為了全面估計GPV VP基因的選擇壓力，通過Datamonkey數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站，使用SLAC、FEL和IFEL方法計算每個密碼子的非同義（dN）和同義（dS）替換率［16］，2種或2種以上方法預(yù)測氨基酸位點同為陽性或陰性方才有效。如果P值<0.05則判定為陽性（dN> dS），反之則為陰性（dN

2 結(jié)果與分析

2.1 GPV的分離鑒定及VP基因的擴(kuò)增

將采集的病料處理后接種鵝胚，發(fā)現(xiàn)有2份采集的病料3～6 d內(nèi)有死胚現(xiàn)象，對照生長發(fā)育正常。收集鵝胚的尿囊液，提取DNA后進(jìn)行PCR并電泳。從圖1可見，2份致死鵝胚的病料在400 bp左右出現(xiàn)條帶，而陰性對照沒有條帶。將2株GPV分離株分別命名為GDQY2017和GDYJ2017。

利用VP基因擴(kuò)增引物擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，經(jīng)電泳后，在2 000 bp左右出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的片段（圖2）。

圖1 GPV鑒別PCR結(jié)果

圖2 GPV VP基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 2株GPV分離株 VP基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank中下載中國大陸和其他國家及地區(qū)報道的水禽細(xì)小病毒的完整VP基因，與本研究分離的2株GPV進(jìn)行序列分析并繪制VP基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖3）顯示，水禽細(xì)小病毒明顯分為兩個遺傳譜系，一個是從鵝和鴨中分離的鵝細(xì)小病毒（GPV），另一個是番鴨細(xì)小病毒（MDPV）。此外，來自不同地區(qū)和不同采集時間的GPV呈復(fù)雜化，GPV聚集成不同的遺傳群體。 鴨源GPV毒株（KT343253和KT751090）和減毒GPV毒株（KX384725）形成不同于經(jīng)典GPV毒株的進(jìn)化譜系。歐洲分離株和亞洲分離株也分別形成不同的譜系。目前的GPV疫苗株（GD、GDaGPV和SYG61v）共同形成一個單獨的進(jìn)化分支。值得注意的是，本研究從廣東分離到的2株GPV毒株形成一個單獨的分支，與廣東原始GPV株GDFSh以及GPV疫苗株SYG26-35、GDaGPV和SYG61v不在同一分支上。

2.3 選擇壓力分析

預(yù)測鵝細(xì)小病毒VP基因的dN/dS值，以確定本研究的2株GPV分離株在選擇壓力下陽性位點的數(shù)量和位置，如圖4所示，dN/dS比率為0.145474，116位點為陽性選擇位點（氨基酸變化：Arg → Gln）。

2.4 2株GPV分離株與GPV疫苗株的VP氨基酸序列比較

GPV的毒力和抗原性與VP蛋白的氨基酸序列有關(guān)。從表2可以看出，2株分離的GPV毒株只有2個氨基酸存在差異，表明這2株病毒的相似性很高。然而，與3種疫苗株相比，這5種病毒總共有22個氨基酸殘基差異，其中15個位于VP3蛋白中。雖然GPV的受體結(jié)合位點（Asn-489和Asn-650）沒有發(fā)生變異，但是位于受體結(jié)合位點附近的476、637氨基酸位點處的變化可能影響現(xiàn)有的GPV疫苗對流行毒株的防控效果。此外，值得注意的是，本研究分離的2株GPV毒株在116位點的氨基酸與3株GPV疫苗株均不同。考慮Arg116Gln是陽性選擇位點，這可能是現(xiàn)有的GPV疫苗不能完全保護(hù)水禽的原因。本研究中分離的2株GPV與疫苗株相比沒有發(fā)生糖基化位點數(shù)量和位置的改變。

3 討論

鵝細(xì)小病毒病是引起雛鵝和雛番鴨高致病率和高致死率的重要疾病，預(yù)防和控制鵝細(xì)小病毒的主要方式是對種鵝接種滅活疫苗。然而，接種了疫苗的鵝和番鴨體內(nèi)產(chǎn)生的抗體滴度不足以傳遞給雛鵝或雛番鴨，這可能是鵝細(xì)小病毒廣泛流行的原因［9，12，17］。廣東省 GPV 疫情逐年增加，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。這一現(xiàn)象表明，廣東省的鵝細(xì)小病毒疫苗可能并不足以保護(hù)水禽。

圖3 水禽細(xì)小病毒VP基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 鵝細(xì)小病毒VP基因點對點選擇壓力分析結(jié)果

表2 2株GPV分離株和3株GPV疫苗株氨基酸差異

VP是鵝細(xì)小病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，VP3是鵝細(xì)小病毒衣殼蛋白的主要成分，也是主要的保護(hù)性抗原，可以刺激水禽產(chǎn)生抗體。本研究中，廣東地區(qū)分離的2株GPV和3株GPV疫苗株中，大多數(shù)氨基酸突變發(fā)生在VP3蛋白中。從系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果可知，2株GPV分離株具有高度同源性，形成一個單獨的遺傳分支，并且與GPV疫苗株（SYG61v、SYG26-35和GDaGPV）和GPV毒力B株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。這可能由于廣東省內(nèi)居民具有偏喜歡消費本地鵝種的特殊飲食習(xí)慣，導(dǎo)致當(dāng)?shù)仄贩N鵝在省內(nèi)廣泛交易，從而使得GPV在廣東省內(nèi)廣泛流行，并且單獨形成了一個遺傳演化譜系。

細(xì)小病毒衣殼表面上的凹痕或突起負(fù)責(zé)識別受體［18］，而糖脂、聚糖和糖蛋白可作為受體協(xié)助細(xì)小病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞［1］，這意味著氨基酸的變化可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)或理化性質(zhì)的改變，從而使得病毒不能進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)［19］。AAV-2的VP蛋白中的5種氨基酸（Arg-484，Arg-487，Lys-532，Arg-585和Arg588）是其受體結(jié)合位點［20-21］，而 GPV 的VP蛋白與AAV-2相似度高，因此GPV在484、487、532、585、588位點的氨基酸變化或這5個位點附近的氨基酸變化可能導(dǎo)致GPV毒力的變化［22］。Fan 等［1］研究表明，鵝細(xì)小病毒在 489位的突變可能使鵝細(xì)小病毒的宿主從鵝擴(kuò)展到鴨的原因。

一般而言，由于病毒可能經(jīng)歷強(qiáng)烈的選擇壓力，使得病毒蛋白質(zhì)中存在陽性選擇位點［23］。本研究分離的2株GPV在Arg116Gln的變化可能是由疫苗接種或其他因素的選擇壓力導(dǎo)致的，這可能造成疫苗產(chǎn)生的抗體不能識別及中和病毒，甚至在接種疫苗后也導(dǎo)致免疫失敗。本研究結(jié)果為中國東南部養(yǎng)鵝行業(yè)疫苗的廣泛失效提供了解釋［28］。

綜上所述，本研究利用系統(tǒng)發(fā)育分析方法分析了2株廣東GPV毒株及其他水禽細(xì)小病毒毒株的完整VP基因序列，證實廣東GPV進(jìn)化為僅在廣東省流行的新遺傳群，GPV的進(jìn)化和突變導(dǎo)致抗原結(jié)合位點之間氨基酸殘基改變，這可能導(dǎo)致目前市場流通的GPV疫苗無法預(yù)防和控制水禽GPV的流行。因此，應(yīng)適時選擇候選GPV毒株進(jìn)行疫苗生產(chǎn)，特別是在某個地理區(qū)域。