蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵杜仲的工藝優(yōu)化

徐麗麗，梁建東，柴宇航，陳萬浩，田維毅，韓燕峰，梁宗琦，王 平

（1.貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州大學(xué)真菌資源研究所，貴州 貴陽 550025）

生物轉(zhuǎn)化是利用微生物、動植物培養(yǎng)體系（包括真菌、細菌、植物離體細胞、組織或器官及動物細胞等）或其產(chǎn)生的酶系對外源性化合物進行修飾以獲得新的衍生物的反應(yīng)過程［1］。在此過程中，真菌因具有分解纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、脂類等營養(yǎng)物質(zhì)的胞內(nèi)或胞外酶系，較強的分解利用能力，及種類繁多、次生代謝產(chǎn)物多等優(yōu)點，因而成為主要的功能菌［2］。隨著人們對健康需求的增加和形勢發(fā)展，許多藥材的傳統(tǒng)應(yīng)用方式已無法滿足市場對這類中藥資源的開發(fā)需求和多樣化應(yīng)用。提高藥材的應(yīng)用范圍和層次，本著減毒、增效、拓展應(yīng)用的目的，結(jié)合真菌與中藥的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)運而生，并逐步深入我國傳統(tǒng)中藥的研發(fā)中，如應(yīng)用蛹蟲草〔Cordyceps militaris （L.） Link〕固態(tài)發(fā)酵西洋參、人參根須等，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵前后人參皂苷的種類及含量均有較大差異，表明蛹蟲草菌株所產(chǎn)生的酶系對傳統(tǒng)中藥具轉(zhuǎn)化作用［3-4］。

杜仲（Eucommia ulmoides oliv）為冰川運動殘留下來的杜仲科植物，主要以樹皮入藥，是貴州主要的道地藥材之一。《中國藥典》規(guī)定其樹皮和葉均可入藥，具備補肝腎、強筋骨、安胎等功效，用于肝虛腎弱、腰酸膝痛、痿軟無力、胎動不安、妊娠漏血［5］?，F(xiàn)代研究表明，杜仲的主要特征性成分為松脂醇二葡萄糖苷（pinoresinol diglucoside，PDG），具雙向調(diào)節(jié)血壓這一特有功能［6］。

通過前期蛹蟲草固體發(fā)酵杜仲的單因素實驗，選出最優(yōu)單因素條件為：添料（杜仲粉）量10%、維生素E（Vitamin E，VE）4 g/kg，葡萄糖4 g/kg，硫酸銨4 g/kg，初始pH 8，接種量40%，最適溫度25℃，培養(yǎng)時間15 d，并且發(fā)現(xiàn)在考察添料（杜仲粉）量、碳源、氮源、初始pH時，PDG和蟲草素的含量同時降低，對于生長因子和接種量則表現(xiàn)為同時升高，而培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間是一升一降。本研究在這些前期實驗基礎(chǔ)上對蛹蟲草固體發(fā)酵杜仲的培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件進一步優(yōu)化，以期最大限度地提高發(fā)酵產(chǎn)物中有效成分PDG和蟲草素的含量，為固體發(fā)酵產(chǎn)物的規(guī)?；a(chǎn)提供參考，也將為發(fā)酵產(chǎn)物在藥品和保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)揮促進作用，服務(wù)于大健康產(chǎn)業(yè)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蛹蟲草菌株C. militaris B1 528于2 015年2月分離自貴陽花溪農(nóng)貿(mào)市場購買的蛹蟲草人工子實體，使用甘油凍存管，-80℃保存于貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院真菌室。

平板培養(yǎng)基：常規(guī)PDA培養(yǎng)基。

液體種子培養(yǎng)基：土豆（20%），葡萄糖（2%），水（1 000 mL），pH值自然。

初始固體發(fā)酵培養(yǎng)基：杜仲粉（30%），大米（70%，自來水浸泡過夜），土豆汁（含20%土豆，0.2%），pH值自然，121℃滅菌45 min。

最終優(yōu)選的固體發(fā)酵培養(yǎng)基：杜仲粉（27%），大米（73%，pH 8的自來水浸泡過夜），VE 4 g/kg、葡萄糖4 g/kg，硫酸銨8 g/kg，土豆汁（含20%土豆，0.2%，pH 8），121℃滅菌45 min。

主要儀器與試劑：HCB-1300V型垂直層流潔凈工作臺（青島海爾特種電器有限公司），HZQ-QB培養(yǎng)搖床、SPX-150A生化培養(yǎng)箱（蘇州威爾實驗用品有限公司），安捷倫高效液相色譜儀1260，200T高速多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司），PL303型精密電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），港威超聲（江蘇省張家港市港威超聲電子有限公司）。松脂醇二葡萄糖苷對照品（北京世記奧科生物技術(shù)有限公司，批號為63902-38-5C32H42016），蟲草素對照品（中國食品藥品檢定研究所，批號為110858-201503），乙腈（色譜純，美國天地），甲醇（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑公司），氯仿（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司），娃哈哈純凈水，杜仲購于貴陽藥材市場（經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院李瑋教授鑒定為杜仲的干燥樹皮）。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 平板培養(yǎng) 將蛹蟲草B1 528轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d。

1.2.2 種子培養(yǎng) 無菌條件下，用打孔器從平板中打取直徑為5 mm的活化菌種并接入液體種子培養(yǎng)基中，于25℃、200 r/min黑暗條件下震蕩培養(yǎng)5 d。

1.2.3 固體發(fā)酵培養(yǎng) 將40%液體菌種移接于初始固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，并于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d（優(yōu)化后培養(yǎng)基培養(yǎng)18 d）。

1.3 檢測方法

精密稱取發(fā)酵產(chǎn)物4.0 g，加入40 mL氯仿液，超聲30 min，棄去氯仿殘液，揮干藥渣，再加入40 mL甲醇，超聲45 min，提取液過濾并濃縮至10 mL以下，移至10 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得發(fā)酵產(chǎn)物提取液［7］，采用高效液相色譜法（HPLC）進行測定。

色譜條件：色譜柱Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫20℃，檢測波長277 nm，流速1.0 mL/min，進樣體積10 μL，流動相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脫條件：0～10 min，95%～85.5%A；10～23 min，85.5%～85.4%A；23～33 min，85.4%～95%A。

1.4 Plackett-Burman實驗

根據(jù)前期單因素實驗結(jié)果，運用Design-Expert.V8.0.6軟件的Plackett-Burman，選取實驗次數(shù)N=12的實驗設(shè)計，對發(fā)酵培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件共8個因素進行考察，每個因素分別取高、低兩個水平，同時另設(shè)3個虛擬變量以考察實驗誤差，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)HPLC法檢測蟲草素和PDG含量，作為PB實驗的響應(yīng)值，篩選顯著因子。

1.5 最陡爬坡實驗

響應(yīng)面擬合方程只有臨近考察領(lǐng)域內(nèi)才能充分體現(xiàn)真實情況，因此采用最陡爬坡法逼近最佳值區(qū)域，建立有效的響應(yīng)面擬合方程。以PB實驗結(jié)果為依據(jù)，以實驗值變化的方向為爬坡方向，結(jié)合各因素效應(yīng)值大小的比例設(shè)定其變化步長，以坡度最高點作為后續(xù)實驗的零點。

1.6 Box-Benhnken實驗

根據(jù)最陡爬坡實驗找到的中心點，利用Design-Expert響應(yīng)面分析中的Box-Benhnken實驗法進行三因素三水平的實驗，取實驗次數(shù)N=15，其中零點實驗重復(fù)3次，以估計實驗誤差，進而得到優(yōu)化條件及相應(yīng)的理論值。

1.7 驗證試驗

對優(yōu)化后的發(fā)酵條件進行平行驗證實驗，以檢驗實驗數(shù)據(jù)與理論預(yù)測值是否相符，從而得到優(yōu)化配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman實驗設(shè)計及顯著因子確定

采用N=12的Plackett-Burman設(shè)計，對接種量（X1）、添料（杜仲粉）量（X2）、培養(yǎng)溫度（X3）、培養(yǎng)時間（X4）、硫酸銨（X5）、初始pH（X6）、VE（X7）、葡萄糖（X8）8個因素進行考察，每個因素分別取高低兩個水平，響應(yīng)值為蟲草素和PDG，實驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

方差分析結(jié)果（表2）表明，添料（杜仲粉）量、培養(yǎng)時間、硫酸銨這3個因素對應(yīng)蟲草素置信區(qū)間95%以上，PDG置信區(qū)間在95%以上的有接種量、添料（杜仲粉）量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、硫酸銨5個因素。其中添料（杜仲粉）量、培養(yǎng)時間、硫酸銨等因素顯著性最明顯，是影響蛹蟲草轉(zhuǎn)化杜仲固體培養(yǎng)的重要因素，因此，把其他因素控制在較好水平上，選擇添料（杜仲粉）量、培養(yǎng)時間、硫酸銨3個因素做進一步響應(yīng)面實驗。

2.2 爬坡實驗

最陡爬坡法是以Plackett-Burman實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，主要因素添料（杜仲粉）量（X2）、培養(yǎng)時間（X4）、硫酸銨（X5）均為正效應(yīng)，爬坡方向應(yīng)增加，根據(jù)其效應(yīng)值大小的比例分別設(shè)定其爬坡步長，蟲草素、PDG及綜合評分為響應(yīng)值。綜合評分是以各成分的最大值為參照將數(shù)據(jù)進行歸一化，再給出不同的權(quán)重，各成分權(quán)重系數(shù)均設(shè)為0.5，Y=（各樣品中蟲草素含量÷樣品中蟲草素最高含量）×0.5×100 +（各樣品中PDG含量÷樣品中PDG最高含量）×0.5×100［8］。由于杜仲濃度過高時菌種生長較弱或未見生長，因此采用添料（杜仲粉）量2%為其爬坡步長。實驗設(shè)計及結(jié)果（表3）表明，實驗3添料（杜仲粉）量（X2）20%、培養(yǎng)時間（X4）18 d、硫酸銨（X5）8.0 g/kg的綜合評分達92.50分，為最優(yōu)實驗條件，因此是后續(xù)實驗的中心點。

表1 Plackett-Burman實驗設(shè)計與結(jié)果

表2 方差分析結(jié)果

2.3 Box-Benhnken實驗及響應(yīng)面分析

在爬坡實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以添料（杜仲粉）量（X2）20%、培養(yǎng)時間（X4）18 d、硫酸銨（X5）8.0 g/kg為中心點，根據(jù)Box-Benhnken實驗設(shè)計進行，實驗設(shè)計及結(jié)果見表4、表5。

表3 最陡爬坡實驗設(shè)計和結(jié)果

表4 Box-Behnken實驗因素與水平

表5 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果

利用Design-Expert V8.0.6.1軟件進行二次回歸擬合，可得到擬合方程：

從方差分析結(jié)果（表6）可知，蟲草素、PDG模型項P值<0.05，說明方程擬合很好；蟲草素、PDG失擬項P值>0.05，說明該方程殘差由隨機誤差引起。模型決定系數(shù)分別為R2=0.9920、0.9337，說明相關(guān)性良好，模型與實際情況擬合很好。

根據(jù)表5的實驗結(jié)果作三維響應(yīng)面圖（圖1、圖2、圖3），并對模型進行求導(dǎo)，對求導(dǎo)結(jié)果四舍五入取整數(shù)得添料（杜仲粉）量（X2）=27、培養(yǎng)時間（X4）=18、硫酸銨（X5）=8，結(jié)合前期單因素實驗結(jié)果，得最優(yōu)培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組成為：VE 4 g/kg，葡萄糖4 g/kg，硫酸銨8 g/kg，初始pH8，添料（杜仲粉）量27%，接種量40%，培養(yǎng)溫度25℃，培養(yǎng)時間18 d，在此條件下蟲草素和PDG的預(yù)測產(chǎn)量分別為2.93、89.00 μg/g。

表6 回歸模型方差分析結(jié)果

圖1 培養(yǎng)時間、添料（杜仲粉）量與PDG產(chǎn)量的響應(yīng)面圖

圖3 硫酸銨、培養(yǎng)時間與PDG產(chǎn)量的響應(yīng)面圖

2.4 實驗結(jié)果驗證

為驗證預(yù)測值的準確性，按響應(yīng)面實驗分析出的最優(yōu)培養(yǎng)基組合和培養(yǎng)條件進行發(fā)酵，并與初始培養(yǎng)基作對比。結(jié)果蟲草素和PDG的產(chǎn)量分別為 2.92±0.07、90.03±1.07 μg/g，與預(yù)測值非常接近，且較優(yōu)化前蟲草素和PDG產(chǎn)量（1.82±0.03、58.88±0.84 μg/g）分別提高60.44%、52.90%。

表7 驗證實驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

采用真菌固體發(fā)酵能顯著提高中藥材中有效成分的含量，如土生曲霉以三七為基質(zhì)原料進行固態(tài)轉(zhuǎn)化，三七中原人參二醇型皂苷Rd及原人參三醇型皂苷Rg1含量得到大幅度提高［9］；冬蟲夏草蝙蝠蛾擬青霉固態(tài)發(fā)酵人參藥材可同時獲得人參稀有皂苷Rd、腺苷、蟲草素、甘露醇等活性物質(zhì)，實現(xiàn)一次發(fā)酵雙向轉(zhuǎn)化，同時獲取兩種藥物的有效成分，起到協(xié)同增效的作用［10］；靈芝發(fā)酵人參殘渣可顯著提升人參皂苷Rd的含量［11］；功能真菌M1固體發(fā)酵人參，能夠大幅度提高人參藥材中總皂苷的含量，其增長率最高可達103.82%［12］。逄世峰等［3］、閆梅霞等［4］的研究也表明，蛹蟲草作為一種食藥用真菌，在中藥的生物轉(zhuǎn)化中是一種可利用的有效資源，與本試驗結(jié)果一致。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件及原材料質(zhì)量對代謝產(chǎn)物的種類及產(chǎn)量均有較大影響，通過改變培養(yǎng)基組份、培養(yǎng)條件，選取高質(zhì)量的藥材和優(yōu)質(zhì)菌種可顯著提高其有效成分的產(chǎn)量及成分配比。本研究選取未經(jīng)任何處理的生杜仲作為試驗材料，以確保藥材的質(zhì)量。在實際生產(chǎn)中，大米作為天然養(yǎng)分，可向培養(yǎng)基提供一定量的碳氮源，培養(yǎng)更易成功。同時，在培養(yǎng)基中添加一些輔料，如維生素B1、復(fù)合碳源（葡萄糖&土豆）等［13］，能促進蛹蟲草培養(yǎng)基中蟲草素的積累及菌絲的生長，調(diào)節(jié)適宜的pH有利于蛹蟲草生長［14］，較高溫度下更利于蛹蟲草中蟲草素的合成和積累［15］。本研究通過Plackett-Burman實驗篩選出添料（杜仲粉）量、培養(yǎng)時間、硫酸銨3個顯著影響蛹蟲草轉(zhuǎn)化杜仲培養(yǎng)基成分的因素，這與添加NH4+對蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)蟲草素具顯著促進作用［16］的結(jié)論相吻合。蛹蟲草利用NH4+合成谷氨酰胺，也就是核苷的間接前體，進而生成核苷［17］，而蟲草素是一種核苷類物質(zhì)，由此說明為什么培養(yǎng)基中添加NH4+可以提高蟲草素的產(chǎn)量了。從微生物代謝角度分析可知，蟲草素合成的直接前體物是腺苷，腺嘌呤、次黃嘌呤等間接參與蟲草素合成［18］。本實驗中蟲草素含量增長，可能還與腺苷、腺嘌呤等化合物的含量變化有關(guān)。杜仲皮中葡萄糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化形成松伯醇［19］，松伯醇經(jīng)松脂醇合酶催化聚合生成松脂醇［20］，松脂醇在酶的作用下糖基化生產(chǎn)PDG［21］，從而構(gòu)成杜仲PDG的生物合成途徑，該途徑中任何一個酶體系的改變都可以影響PDG的產(chǎn)量，本實驗利用蛹蟲草所具有的酶系去影響PDG合成途徑，使其產(chǎn)量發(fā)生改變。