不同培養(yǎng)基對(duì)蝴蝶蘭雜交種子無菌播種生長(zhǎng)的影響

陳春滿，張善信，范俊強(qiáng)，羅耿周

（東莞市生物技術(shù)研究所，廣東 東莞 523086）

蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）是著名的蘭花品種，原產(chǎn)于亞洲熱帶地區(qū)，從喜馬拉亞山到澳洲北部均有分布。其花型、花色豐富多彩，花朵數(shù)多，開花期長(zhǎng)，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛，被譽(yù)為“蘭花皇后”。蝴蝶蘭可通過人工調(diào)控花期于春節(jié)前開放，極大滿足了國(guó)內(nèi)年宵花的市場(chǎng)需求。隨著種植面積和產(chǎn)銷量的急速增加，我國(guó)蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)得到跨越式發(fā)展，大陸已逐漸成為全球蝴蝶蘭種苗供應(yīng)中心。

蝴蝶蘭種質(zhì)資源豐富，通過人工雜交可培育出新品種。我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的蝴蝶蘭育種走在世界前列，我國(guó)大陸于20世紀(jì)90年代也開始進(jìn)行蝴蝶蘭新品種選育工作，已陸續(xù)不斷有新品種問市［1-5］。在新品種培育過程中，播種是很關(guān)鍵的一步，不同的品種雜交、不同的試驗(yàn)方法均會(huì)影響到小苗的出苗率。余慧琳等［6］、田甜［7］認(rèn)為基本培養(yǎng)基影響蝴蝶蘭雜交種子的萌發(fā)，徐曉薇等［8-10］認(rèn)為椰子水有利于蝴蝶蘭種子的萌發(fā)。為此我們?cè)O(shè)計(jì)了不同的方案進(jìn)行播種試驗(yàn)，以探索出蝴蝶蘭不同雜交種子萌發(fā)、分化、壯苗及生根的最有利因子，為蝴蝶蘭雜交育種的長(zhǎng)足發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雜交用的大花型母本植株大辣椒和紅太陽(yáng)從廣州花之美園藝公司引進(jìn)，小花型母本植株小深紅、白唇、小白兔和紅鉆從福建漳州鉅寶生物科技有限公司引進(jìn)。參試的8個(gè)雜交組合分別為：1號(hào)：大辣椒（♀）× 白唇（♂）；2號(hào)：白唇（♀）×大辣椒（♂）；3號(hào)：紅鉆自交；4號(hào)：小白兔（♀）×大辣椒（♂）；5號(hào)：大辣椒自交；6號(hào)：紅鉆（♀）×大辣椒（♂）；7號(hào)：大辣椒（♀）×紅太陽(yáng)（♂）；8號(hào)：小深紅（♀）×大辣椒（♂）。其中，1～3號(hào)授粉后4個(gè)月采摘其雜交果莢進(jìn)行播種，用于觀察種子萌發(fā)；2號(hào)和4～6號(hào)的種芽用于觀察基本培養(yǎng)基對(duì)芽分化生長(zhǎng)的影響；1～8號(hào)用于觀察有機(jī)附加物對(duì)芽分化生長(zhǎng)的影響，種芽為種子萌發(fā)后40～50 d、直徑大小0.2～0.3 cm的胚性芽；1號(hào)和3～4號(hào)雜交種子生長(zhǎng)形成的小苗用于觀察其在壯苗和生根階段的生長(zhǎng)情況，每株小苗具有兩片0.5～1.0 cm的小葉，無根。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果莢處理 授粉后4個(gè)月的成熟蝴蝶蘭雜交果莢經(jīng)自來水沖選干凈，用75%酒精表面消毒1 min，滅菌水沖洗1次，在無菌超凈臺(tái)上用0.1%升汞滅菌8 min，再用滅菌水沖洗3次后取出。在無菌碟上，用解剖刀縱向切開果莢，將粉狀種子輕輕夾出，撒播在無菌的誘導(dǎo)萌發(fā)培養(yǎng)基上，每個(gè)果莢的粉狀種子可均勻撒播在5～6瓶培養(yǎng)基上。

1.2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)蝴蝶蘭雜交種子萌發(fā)的影響 測(cè)定種子萌發(fā)的培養(yǎng)基共6個(gè)：處理1：MS+椰子水100 mL/L、處理2：1/2MS+椰子水100 mL/L、處理3：1/3MS+椰子水100 mL/L、處理4：1/4MS+椰子水100 mL/L、處理5：1/2MS+馬鈴薯汁100 g/L、處理6：1/2MS+蘋果汁10 g/L。每個(gè)處理均添加2.5%白糖、瓊脂6 g/L，pH調(diào)節(jié)至5.6～5.8，下同。試驗(yàn)在恒溫恒光條件下進(jìn)行，培養(yǎng)溫度25～28℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx、光照時(shí)間12 h/d。1～3號(hào)蝴蝶蘭雜交種子均分為6份，每個(gè)處理接種1份，每份接種1瓶，5次重復(fù)，播種后40 d統(tǒng)計(jì)不同處理每瓶種子萌發(fā)數(shù)量，取平均值。

1.2.3 不同基本培養(yǎng)基對(duì)蝴蝶蘭雜交種子芽分化生長(zhǎng)的影響 以萌發(fā)后的胚性芽為試材，以MS、1/2MS、1/3MS為基本培養(yǎng)基，分別添加馬鈴薯汁150 g/L，觀察3個(gè)基本培養(yǎng)基對(duì)2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)4個(gè)雜交種子芽分化生長(zhǎng)的影響。每個(gè)處理接種10瓶，40 d后觀察記錄鮮重增加值。

1.2.4 添加不同有機(jī)附加物對(duì)蝴蝶蘭雜交種子芽分化生長(zhǎng)的影響 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，分別添加馬鈴薯汁0～150 g/L、椰子水0～100 mL/L、香蕉汁0～100 g/L，共9個(gè)處理（T1：1/2MS+馬鈴薯汁50 g/L、T2：1/2MS+馬鈴薯汁100 g/L、T3：1/2MS+馬鈴薯汁150 g/L、T4：1/2MS+椰子水100 mL/L、T5：1/2MS+椰子水100 mL/L+馬鈴薯汁100 g/L、T6：1/2MS+椰子水100 mL/L+馬鈴薯汁50 g/L、T7：1/2MS+香蕉汁50 g/L+馬鈴薯汁50 g/L、T8：1/2MS+香蕉汁100 g/L+馬鈴薯汁50 g/L、T9：1/2MS+香蕉汁100 g/L），每個(gè)處理10瓶，觀察不同有機(jī)附加物對(duì)8個(gè)雜交種子芽分化生長(zhǎng)的影響，40 d后記錄每瓶鮮重增加值。

1.2.5 不同培養(yǎng)基對(duì)蝴蝶蘭雜交種子組培苗壯苗和生根生長(zhǎng)的影響 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，分別添加馬鈴薯汁150 g/L、椰子水0～100 mL/L、香蕉汁0～100 g/L、白糖2.5%～3.0%，共6個(gè)處理（C1：1/2MS+馬鈴薯汁150 g/L+白糖2.5%、C2：1/2MS+馬鈴薯汁150 g/L+白糖3%、C3：1/2MS+香蕉汁25 g/L+馬鈴薯汁150 g/L+白糖2.5%、C4：1/2MS+香蕉汁50 g/L+馬鈴薯汁150 g/L+白糖2.5%、C5：1/2MS+香蕉汁100 g/L+馬鈴薯汁150 g/L+白糖2.5%、C6：1/2MS+馬鈴薯汁150 g/L+椰子水100 mL/L+白糖2.5%），觀察其對(duì)1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)3個(gè)雜交種子組培苗壯苗和生根生長(zhǎng)的影響。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種25株苗，培養(yǎng)前后稱重，60 d后記錄不同處理根、莖、葉鮮重，統(tǒng)計(jì)不同處理培養(yǎng)后莖葉、根及總鮮重的平均增長(zhǎng)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

采用Excel整理數(shù)據(jù)，采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，LSD法進(jìn)行多重比較和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)蝴蝶蘭雜交種子萌發(fā)的影響

由圖1可知，在以1/3 MS為基本培養(yǎng)基的處理3中，3個(gè)不同蝴蝶蘭雜交組合種子萌發(fā)率高于以1/4 MS為基本培養(yǎng)基的處理4及以MS和1/2MS作基本培養(yǎng)基的處理1和處理2。處理3中的3個(gè)雜交種子均表現(xiàn)為萌發(fā)率較高、顆粒較大，散落在瓶子周圍的顆粒均能發(fā)芽，處理4的萌發(fā)情況稍差于處理3，處理1最差，表現(xiàn)為不萌芽或種子萌發(fā)但死亡較多。表明一定的低鹽濃度有利于蝴蝶蘭種子萌發(fā)，過高或過低的鹽濃度均不利于種子萌發(fā)。以1/2MS為基本培養(yǎng)基添加馬鈴薯汁100 g/L的處理6種子萌發(fā)率高、顆粒大、長(zhǎng)勢(shì)旺，表現(xiàn)最好；添加椰子水100 mL/L的處理次之，添加蘋果汁10 g/L的處理最差，表現(xiàn)為萌芽率低、萌發(fā)后死亡現(xiàn)象多、無活力，表明不同有機(jī)附加物對(duì)蝴蝶蘭種子萌發(fā)有較大影響（圖2～圖4，封二）。

圖1 3個(gè)蝴蝶蘭雜交種子在6種培養(yǎng)基的萌發(fā)比較

2.2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)蝴蝶蘭雜交種子芽分化生長(zhǎng)的影響

不同基本培養(yǎng)基對(duì)蝴蝶蘭雜交種子芽生長(zhǎng)的影響如表1所示。以1/2MS為基本培養(yǎng)基的雜交種子芽表現(xiàn)為鮮重較重，除7號(hào)外，其他種子芽在1/2MS培養(yǎng)基中的鮮重均大于MS或1/3MS，表現(xiàn)為長(zhǎng)葉長(zhǎng)根較快、葉子大、芽多、長(zhǎng)勢(shì)好（圖5，封二）。表明多數(shù)蝴蝶蘭雜交種子在相同培養(yǎng)基處理中的表現(xiàn)類似，即過高鹽濃度（MS）對(duì)蝴蝶蘭雜交種子芽的分化和生長(zhǎng)不利，過低鹽濃度（1/3MS）養(yǎng)分不足，植株生長(zhǎng)也不好。以1/2MS為基本培養(yǎng)基的處理其植株鮮重和長(zhǎng)勢(shì)均較好。不同雜交種子芽的分化速度不同，以6號(hào)分化效果較好，表現(xiàn)為鮮重較重；而7號(hào)種子芽的分化和生長(zhǎng)能力較低，鮮重較輕。

表1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)蝴蝶蘭雜交種子芽鮮重（g）影響

2.3 添加不同有機(jī)附加物對(duì)蝴蝶蘭雜交種子芽分化生長(zhǎng)的影響

8個(gè)雜交種子胚性芽在添加不同有機(jī)附加物培養(yǎng)基中的表現(xiàn)如表2所示。從表2可以看出，以添加馬鈴薯汁150 g/L的T3處理的芽分化生長(zhǎng)效果最好、平均芽鮮重為26.60 g，其次是T5、平均鮮重為19.32 g。只添加馬鈴薯汁50 g/L（T1）和香蕉汁100 g/L（T9）處理的芽生長(zhǎng)較差，鮮重分別只有12.08、14.76 g。表明添加一定量的馬鈴薯汁有利于蝴蝶蘭芽分化期的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為鮮重增加明顯、葉片分化快、根莖葉較重。在相同培養(yǎng)基處理中，不同蝴蝶蘭雜交種子芽生長(zhǎng)情況不一致。8號(hào)雜交種子芽生長(zhǎng)勢(shì)最好，表現(xiàn)為平均鮮重最重、為29.97 g，其次是3號(hào)和6號(hào)，鮮重分別為23.86、21.34 g，而7號(hào)種子萌發(fā)后鮮重生長(zhǎng)勢(shì)最差，平均鮮重只有3.4 g，表明不同雜交種子芽在離體環(huán)境中適應(yīng)程度不同。

表2 添加不同有機(jī)附加物對(duì)蝴蝶蘭雜交種子芽鮮重（g）的影響

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)蝴蝶蘭雜交種子組培苗壯苗和生根生長(zhǎng)的影響

圖6 不同培養(yǎng)基對(duì)1號(hào)蝴蝶蘭雜交種子組培苗壯苗和生根生長(zhǎng)的影響

圖7 不同培養(yǎng)基對(duì)3號(hào)蝴蝶蘭雜交種子組培苗壯苗和生根生長(zhǎng)的影響

圖8 不同培養(yǎng)基對(duì)4號(hào)蝴蝶蘭雜交種子組培苗壯苗和生根生長(zhǎng)的影響

從圖6～圖8可以看出，3個(gè)蝴蝶蘭雜交種子在C5培養(yǎng)基中的組培苗總鮮重、根重和莖葉重的平均增長(zhǎng)量顯著優(yōu)于其他處理，表現(xiàn)為葉子挺立、葉大而多、根系、長(zhǎng)勢(shì)好。表明不同雜交種在組培苗的壯苗和生根階段對(duì)培養(yǎng)基的要求較為一致。但是不同雜交種的組培苗生長(zhǎng)速度和整齊度不一致，3號(hào)種子組培苗生長(zhǎng)勢(shì)較好，在不同處理中均表現(xiàn)為長(zhǎng)勢(shì)好、整齊（圖9，封二）。而1號(hào)種子苗在不同處理中的葉子長(zhǎng)勢(shì)均不佳。添加椰子水100 mL/L的C6培養(yǎng)基中組培苗表現(xiàn)為根少、葉片小，可見椰子水不利于組培苗的壯苗和生根。添加白糖濃度為3%的培養(yǎng)基中，除3號(hào)種子根系鮮重顯著增加外，大部分組培苗的葉片鮮重和總鮮重增長(zhǎng)沒有顯著增加，表明白糖適當(dāng)減少對(duì)多數(shù)品種生長(zhǎng)有利。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，不同蝴蝶蘭雜交種子離體培養(yǎng)過程中，在種子萌發(fā)、芽分化和壯苗生根階段，其生長(zhǎng)表現(xiàn)不同，有些雜交種呈現(xiàn)萌發(fā)率高、芽分化和生長(zhǎng)速度快、苗較壯實(shí)，而有些雜交種表現(xiàn)為適應(yīng)性較差，萌發(fā)率較低、生長(zhǎng)分化較為緩慢，這與魏翠華等［16］報(bào)道一致，可能與不同雜交種的基因型不同有關(guān)。

基本培養(yǎng)基對(duì)不同蝴蝶蘭雜交種子的組培苗生長(zhǎng)有較相似作用。在種子萌發(fā)階段，以1/3MS為基本培養(yǎng)基的雜交種子萌發(fā)效果均較好，表現(xiàn)為萌發(fā)率高、顆粒大、長(zhǎng)勢(shì)好［11-16］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，1/2MS優(yōu)于MS和1/4MS，但1/3MS在不同的雜交組合中種子萌發(fā)情況更優(yōu)于1/2MS，是對(duì)前人工作的一種補(bǔ)充。在芽的分化和壯苗階段以1/2MS作為基本培養(yǎng)基，苗的生長(zhǎng)效果較好，表現(xiàn)為鮮重較重、葉子分化較快、苗壯，表明種子在不同生長(zhǎng)階段需要不同的鹽濃度比例。在萌發(fā)階段需要更低的鹽濃度，過高或過低的無機(jī)鹽濃度均不利于種子萌發(fā)。在芽的分化和壯苗階段，培養(yǎng)基中的鹽濃度需要比種子萌發(fā)階段提高一些，這可能是因?yàn)榉N子發(fā)育后期需要稍高濃度的營(yíng)養(yǎng)元素。

有機(jī)附加物對(duì)不同雜交種子組培苗生長(zhǎng)有較相似作用［18-21］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同蝴蝶蘭雜交種子在萌發(fā)和生長(zhǎng)階段，添加馬鈴薯汁比椰子水有更明顯的促進(jìn)作用。這與余慧琳等［6-9］的報(bào)道有所差異，他們認(rèn)為椰子水更有利于蝴蝶蘭種子的萌發(fā)，需要更進(jìn)一步的驗(yàn)證。在芽分化階段，馬鈴薯汁較高濃度（150 g/L）優(yōu)于較低濃度（50 g/L）；在壯苗和生根階段，較高濃度的馬鈴薯汁和香蕉汁具有明顯的促進(jìn)作用，表現(xiàn)為根莖葉生長(zhǎng)明顯，表明馬鈴薯汁在蝴蝶蘭種子播種和組培生長(zhǎng)過程中有重要作用，與杜云安［17］研究結(jié)論相符。這可能與馬鈴薯汁富含蛋白質(zhì)、硫胺素、維生素C、維生素E、維生素A、磷、鉀等［22］有關(guān)。添加香蕉汁利于組培苗后期生長(zhǎng)，用量大作用更明顯，也與杜云安［17］報(bào)道一致。

本試驗(yàn)中，蝴蝶蘭種子從萌發(fā)到生根壯苗，均不需要加入外源激素，種子自身的激素已足以使其快速萌發(fā)和增殖。從生產(chǎn)角度考慮，如果要快速增加庫(kù)存量，可以增加一定量的外源激素，如果作為雜交種后代的選育，我們認(rèn)為不需要加入外源激素也可正常獲得較大量的后代數(shù)量。