Fe²⁺急性脅迫對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)組織結(jié)構(gòu)的影響

宮春光 殷蕊 孫桂清 于清海 石艷潔 張建業(yè)

摘 要：為探究重金屬Fe2+對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)（Synechogobius hasta）組織結(jié)構(gòu)的影響，在水溫16.5 ℃、鹽度30‰、pH 8.0的環(huán)境下，進(jìn)行了Fe2+對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)的急性脅迫實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)對(duì)Fe2+異常敏感，最小濃度組5 mg/L的平均死亡時(shí)間僅為5.2 h；在各種組織器官中，F(xiàn)e2+對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)的鰓組織損傷最為明顯，會(huì)造成鰓絲充血，鰓小片上皮細(xì)胞增生，從而嚴(yán)重阻礙魚(yú)的呼吸機(jī)能。

關(guān)鍵詞：斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)（Synechogobius hasta）；Fe2+；急性脅迫；組織結(jié)構(gòu)

斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)（Synechogobius hasta），與矛尾復(fù)鰕虎魚(yú)同物異名，隸屬鱸形總目（Perciformes），鰕虎魚(yú)亞目（Gobioidei）鰕虎魚(yú)科（Gobiidae）鰕虎魚(yú)亞科（Gobiinae），復(fù)鰕虎魚(yú)屬（Synechogobius）[1]。在我國(guó)黃渤海、東海、臺(tái)灣海峽及周邊半咸水水域均有分布，屬底棲魚(yú)類(lèi)，多棲息于沙泥底質(zhì)。斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)生命周期僅一冬齡，親魚(yú)早春4月產(chǎn)卵后大部分死亡，捕獲的野生個(gè)體大小不等，通常在50～200 g/尾，經(jīng)濟(jì)價(jià)值不高，屬沿海小型雜魚(yú)[2-3]，由于其具有攝食蝦苗的習(xí)性，因此在沿海對(duì)蝦養(yǎng)殖中往往被作為敵害生物對(duì)待，通過(guò)蝦池進(jìn)水時(shí)的密網(wǎng)（80目篩絹）過(guò)濾或進(jìn)水后使用茶粕予以清除。

國(guó)家蝦產(chǎn)業(yè)體系近幾年的研究結(jié)果表明，利用生物防控技術(shù)對(duì)某些病毒性蝦病的防控能夠取得較好效果，通過(guò)在蝦池中混養(yǎng)魚(yú)類(lèi)，利用魚(yú)類(lèi)攝食病死蝦以減少蝦病的傳播。以往所公布的混養(yǎng)魚(yú)類(lèi)均為規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖品種，人們對(duì)這些品種的研究相對(duì)較多，對(duì)不同品種的生態(tài)環(huán)境適應(yīng)性了解較多，容易處理混養(yǎng)中的各種問(wèn)題。在國(guó)家蝦產(chǎn)業(yè)體系以往所列的混養(yǎng)魚(yú)類(lèi)中并無(wú)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)，但2017年河北省對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐表明，該魚(yú)的混養(yǎng)效果在各種混養(yǎng)魚(yú)類(lèi)中表現(xiàn)最好，尤其是在中國(guó)對(duì)蝦的養(yǎng)殖中。在每hm2放養(yǎng)600尾左右的斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)時(shí)能夠取得較理想的效果，即攝食病死蝦的比例超過(guò)70%（攝食健康蝦的比例低于30%），同時(shí)基本控制了病毒性蝦病（尤其是白斑綜合征（WSD））的流行，斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)未來(lái)有望成為重要的對(duì)蝦養(yǎng)殖生物防控混養(yǎng)魚(yú)類(lèi)。而目前該魚(yú)尚未有人工規(guī)?；B(yǎng)殖，市場(chǎng)上的商品多來(lái)自海捕和蝦池捕撈，人們對(duì)其生態(tài)環(huán)境要求及各種環(huán)境脅迫（包括藥物脅迫）對(duì)其影響缺乏了解，在養(yǎng)殖中環(huán)境調(diào)控和藥物使用缺乏依據(jù)，亟需進(jìn)行相關(guān)研究。河北省很多蝦池利用地下咸水進(jìn)行養(yǎng)殖，地下水中的Fe2+含量往往過(guò)高，而Fe2+對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)的影響尚不得而知。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究Fe2+急性脅迫后該魚(yú)的組織結(jié)構(gòu)變化，以闡明Fe2+對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)的影響，豐富該魚(yú)環(huán)境脅迫反應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)，為養(yǎng)殖實(shí)踐提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)捕撈自河北省黃驊地區(qū)沿海，平均全長(zhǎng)34.05 cm，平均體重142.94 g；實(shí)驗(yàn)水槽為體積30 L水族箱；實(shí)驗(yàn)用水為海水晶+曝氣1 d的自來(lái)水配制的人工海水；添加的Fe2+使用硫酸亞鐵分析純。制作切片的各種試劑為常規(guī)試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)在正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前暫養(yǎng)2 d，選用規(guī)格相近、體色正常、體表無(wú)外傷、健壯的個(gè)體用于脅迫實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)用水水溫16.5 ℃、鹽度30‰、pH 8.0；在水族箱中加入20 L人工海水，以Fe2+為計(jì)算單位加入硫酸亞鐵，濃度設(shè)置為5、50和500 mg/L，每組設(shè)3個(gè)平行，設(shè)一個(gè)對(duì)照組；配制好藥液后在每個(gè)箱中放入2條實(shí)驗(yàn)魚(yú)，不充氣，靜水實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間不投喂。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后觀察不同濃度組實(shí)驗(yàn)魚(yú)的游動(dòng)情況、呼吸頻率、黏液分泌等表征；實(shí)驗(yàn)魚(yú)一旦出現(xiàn)死亡，立即解剖，取鰓、肝臟、腎臟和脾臟，Bouin氏液固定，經(jīng)自來(lái)水沖洗、梯度酒精脫水、透明、透蠟和石蠟包埋等步驟后進(jìn)行切片，切片厚度5 μm；采用蘇木精-伊紅染色法（H. E）染色，BK5000顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)表征 硫酸亞鐵加入水中后，實(shí)驗(yàn)用水很快變成紅褐色，0.5 h后逐漸產(chǎn)生紅褐色沉淀，藥物濃度越大越明顯。實(shí)驗(yàn)魚(yú)放入水中后，除開(kāi)始時(shí)有短暫應(yīng)激反應(yīng)外，基本沒(méi)有異常表現(xiàn)，比較安靜，僅胸鰭微微擺動(dòng)，與對(duì)照組相同。10 min后500 mg/L濃度組實(shí)驗(yàn)魚(yú)開(kāi)始急速游動(dòng)，30 min后逐漸趨于平靜（麻痹）；50 mg/L 濃度組在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到2 h時(shí)出現(xiàn)5 min左右的劇烈游動(dòng)，其后反應(yīng)平靜；5 mg/L濃度組實(shí)驗(yàn)魚(yú)始終處于平靜狀態(tài)。500 mg/L濃度組實(shí)驗(yàn)魚(yú)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始1.5 h后體色變淺、發(fā)白，50 mg/L濃度組實(shí)驗(yàn)魚(yú)3 h后體色開(kāi)始發(fā)白，5 mg/L濃度組實(shí)驗(yàn)魚(yú)體色始終無(wú)變化。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始0.5 h后，所有加入Fe2+實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)魚(yú)黏液分泌開(kāi)始增多，表現(xiàn)為水中出現(xiàn)絮狀物，藥物濃度越高絮狀物越多。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始0.5 h時(shí)，對(duì)照組魚(yú)鰓蓋張合次數(shù)為平均27次/min，5 mg/L濃度組為平均32次/min，50 mg/L濃度組為平均33次/min，500 mg/L濃度組為平均52次/min；實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2 h時(shí)，對(duì)照組魚(yú)鰓蓋張合次數(shù)為平均26次/min，5 mg/L濃度組為平均34次/min，50 mg/L組為平均41次/min，500 mg/L組為平均20次/min；實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2.5 h，500 mg/L濃度組開(kāi)始有死亡出現(xiàn)，該濃度組魚(yú)鰓蓋張合次數(shù)平均僅為9次/min，對(duì)照組魚(yú)鰓蓋張合次數(shù)為27次/min，5 mg/L濃度組為38次/min，50 mg/L濃度組為平均22次/min。

500 mg/L濃度組實(shí)驗(yàn)魚(yú)在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2.5 h開(kāi)始陸續(xù)死亡，平均死亡時(shí)間為2.7 h；50 mg/L濃度組實(shí)驗(yàn)魚(yú)在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3.2 h開(kāi)始陸續(xù)死亡，平均死亡時(shí)間為3.4 h；5 mg/L濃度組實(shí)驗(yàn)魚(yú)在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4.3 h開(kāi)始陸續(xù)死亡，平均死亡時(shí)間為5.2 h。對(duì)照組魚(yú)沒(méi)有出現(xiàn)死亡。

2.1.2 Fe2+對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)組織結(jié)構(gòu)的影響 不同濃度Fe2+急性脅迫對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)鰓、肝臟、腎臟和脾臟的組織結(jié)構(gòu)影響見(jiàn)圖版I-圖版IV（見(jiàn)封二、封三）。

2.2 分析

硫酸亞鐵加入水中后，由于Fe2+氧化成Fe3+，水變成紅褐色并逐漸產(chǎn)生紅褐色沉淀，這與生產(chǎn)實(shí)際相同。河北省多數(shù)地區(qū)如昌黎、樂(lè)亭等地工廠(chǎng)化養(yǎng)殖牙鲆所抽取的地下水半咸水中Fe2+含量超標(biāo)，地下水初始時(shí)清澈透明，但曝氣后很快變成紅褐色，停止充氣后會(huì)在池底形成厚厚一層紅褐色的沉淀。沉淀物易黏附在魚(yú)鰓上，阻礙魚(yú)的正常呼吸，在工廠(chǎng)化養(yǎng)殖持續(xù)充氣的情況下，魚(yú)不會(huì)很快死亡，但魚(yú)的體質(zhì)變差，抗逆能力下降，易感染各種生物病原性疾病。

50 mg/L濃度組實(shí)驗(yàn)魚(yú)在2 h內(nèi)保持平靜，5 mg/L濃度組實(shí)驗(yàn)魚(yú)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中始終比較平靜，說(shuō)明Fe2+本身并非強(qiáng)刺激性藥物，其作用是逐漸顯現(xiàn)的。硫酸亞鐵有一定收斂作用，可抑制腺細(xì)胞的分泌，使魚(yú)的黏膜細(xì)胞脫落[4]，但實(shí)驗(yàn)魚(yú)卻分泌了大量黏液，這可能與實(shí)驗(yàn)魚(yú)呼吸受到阻礙有關(guān)。500 mg/L濃度組的實(shí)驗(yàn)魚(yú)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始10 min時(shí)開(kāi)始急速游動(dòng)，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行0.5 h時(shí)，鰓蓋張合次數(shù)達(dá)到52次/min（對(duì)照組則為27次/min），說(shuō)明高濃度的Fe2+對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)的刺激較強(qiáng)，而當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2 h時(shí)，鰓蓋張合次數(shù)降為20次/min，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2.5 h（到了接近死亡時(shí)），鰓蓋張合次數(shù)降到了僅為9次/min，這種表現(xiàn)一方面符合毒物對(duì)生物的脅迫規(guī)律，即先興奮，后逐漸麻痹；另一方面也說(shuō)明Fe2+對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)的主要影響是妨礙其呼吸功能。另外2個(gè)濃度組也有類(lèi)似表現(xiàn)，只不過(guò)發(fā)生的時(shí)間有所區(qū)別。

本次實(shí)驗(yàn)中斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)在Fe2+脅迫下死亡較快，500 mg/L濃度組僅為2.7 h，5 mg/L濃度組也僅僅5.2 h。分析其原因可能有兩點(diǎn)：一是實(shí)驗(yàn)魚(yú)暫養(yǎng)時(shí)間較短，還沒(méi)有完全適應(yīng)小水體+人工海水的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，其自身處于應(yīng)激狀態(tài)，對(duì)藥物的抗性較差；二是斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)對(duì)Fe2+非常敏感。為進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，我們又進(jìn)行了一次低濃度脅迫實(shí)驗(yàn)，即將Fe2+濃度梯度設(shè)置為1、2和4 mg/L，其它實(shí)驗(yàn)條件相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1 mg/L濃度組的平均死亡時(shí)間為25.4 h，2 mg/L濃度組為19.5 h，4 mg/L濃度組為7.5 h。低濃度脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)的確對(duì)Fe2+異常敏感。

組織切片結(jié)果顯示，F(xiàn)e2+對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)肝臟、腎臟和脾臟的影響相對(duì)較小，5 mg/L和50 mg/L濃度組的肝臟主要表現(xiàn)為輕度的水泡變性，腎臟主要表現(xiàn)為顆粒變性，脾臟主要表現(xiàn)為輕度萎縮和網(wǎng)狀細(xì)胞偽足伸長(zhǎng)。這些表現(xiàn)在魚(yú)的一般性應(yīng)激中也經(jīng)常存在，不能確定是Fe2+所造成的。而500 mg/L濃度組的肝臟（包括胰臟）出現(xiàn)了程度較深的水泡變性，腎臟的顆粒變性較嚴(yán)重，脾臟出現(xiàn)了一定程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象。這些變化很難在一般的應(yīng)激中出現(xiàn)，可以認(rèn)為是高濃度Fe2+所造成的，但總體上組織變化仍屬于較輕的程度。這種結(jié)果可能是藥物浸泡時(shí)間較短，實(shí)驗(yàn)魚(yú)死亡較快所造成的，但也可以確定Fe2+急性脅迫對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)的肝臟、腎臟和脾臟的損傷較小。

Fe2+對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)的鰓組織影響最大，在不同濃度組都表現(xiàn)得非常明顯。5 mg/L濃度組的鰓即表現(xiàn)出明顯的充血和上皮細(xì)胞增生的現(xiàn)象（圖版I-2、3）；50 mg/L濃度組的鰓小片明顯腫脹，入鰓動(dòng)脈明顯擴(kuò)張，鰓小片和入鰓動(dòng)脈中充滿(mǎn)血細(xì)胞（圖版I-4）；而500 mg/L濃度組的鰓小片上皮細(xì)胞已經(jīng)嚴(yán)重增生，部分鰓小片出現(xiàn)融合現(xiàn)象，有的鰓小片嚴(yán)重膨脹，體積是正常鰓小片的數(shù)倍（圖版I-5、6）?？梢钥闯觯邛w、肝臟、腎臟和脾臟這4種組織器官中，F(xiàn)e2+對(duì)鰓組織的損傷最嚴(yán)重，極大影響到了其正常的呼吸機(jī)能，是造成實(shí)驗(yàn)魚(yú)死亡的主要因素。

鑒于斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低和以往作為敵害魚(yú)類(lèi)的認(rèn)識(shí)，人們對(duì)該魚(yú)的研究相對(duì)較少，有關(guān)其生長(zhǎng)及繁殖的報(bào)道僅有幾篇，如羅剛等進(jìn)行了矛尾復(fù)鰕虎魚(yú)性腺發(fā)育及個(gè)體繁殖力研究[5]，還進(jìn)行了矛尾復(fù)鰕虎魚(yú)越冬暫養(yǎng)技術(shù)的研究[6]，李莉等進(jìn)行了矛尾復(fù)鰕虎魚(yú)室內(nèi)人工繁育實(shí)驗(yàn)研究[7]，李春嶺等進(jìn)行了渤海矛尾復(fù)鰕虎魚(yú)生殖力的研究[8]。有關(guān)環(huán)境（藥物）脅迫的報(bào)道也較少，僅有劉香江等研究了銅、鎘和乙酰甲胺磷對(duì)矛尾復(fù)鰕虎魚(yú)的急性毒性影響[7]，黃超等研究了水體銅和鋅暴露對(duì)矛尾復(fù)鰕虎魚(yú)肝臟脂代謝的影響[10]，稅春等研究了鹽度漸變對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)幼魚(yú)血清滲透壓和離子濃度及鰓絲Na+/K+–ATP酶活力的影響[11]。本項(xiàng)研究首次闡明了Fe2+對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)的組織結(jié)構(gòu)影響，為進(jìn)一步探討環(huán)境（藥物）脅迫對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚(yú)的影響機(jī)理奠定了一定基礎(chǔ)。研究結(jié)果可用于養(yǎng)殖實(shí)踐，為魚(yú)、蝦混養(yǎng)時(shí)藥物的使用提供一定的理論依據(jù)。

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