鄰苯二甲酸酯高效降解菌的篩選及表征

楊 捷， 姚炎華， 尹大強， 葉秀云

(1． 福州大學 福建省海洋酶工程重點實驗室， 福建 福州 350116; 2. 同濟大學 長江水環(huán)境教育部重點實驗室，上海 200092)

鄰苯二甲酸酯類(phthalate esters ，PAEs)作為塑料添加劑和軟化劑廣泛用于塑料產(chǎn)品、皮革、建筑材料、個人護理產(chǎn)品、洗滌劑、油漆等產(chǎn)品中[1].PAEs的一般結(jié)構(gòu)由一個苯環(huán)和兩個側(cè)鏈組成，不同的PAEs的區(qū)別在于側(cè)鏈基團的不同.PAEs的種類繁多，包括具有簡單側(cè)鏈基團的鄰苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate，DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate，DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)，和具有復(fù)雜側(cè)鏈基團的鄰苯二甲酸丁芐酯(benzyl butyl phthalate，BBP)、鄰苯二甲酸二(2─乙基己)酯(di-2-ethylhexylPhthalate，DEHP).在塑料制品中，PAEs以氫鍵或范德華力與塑料連接，這種不牢固的化學鍵使PAEs較容易從塑料中釋放出來，造成了對大氣、水體、土壤的污染[2].PAEs已成為全球最普遍的有機污染物之一，多種PAEs在全球主要工業(yè)國的生態(tài)環(huán)境中都達到了普遍檢出程度，其中DBP、DEHP、DMP最常被檢測出[3]，濃度一般在mg·L-1級別.在增塑劑生產(chǎn)過程產(chǎn)生的污水屬于高濃度有機污染廢水，PAEs濃度高[4].

PAEs是一類具有類似于雌激素作用的內(nèi)分泌干擾物，且對動物具有致畸性、致突變性、致癌性以及生殖毒性[5]，具有低濃度長期危害特征.其污染控制己受到全球性關(guān)注，美國環(huán)保局(EPA)、中國環(huán)境監(jiān)測總站及歐盟都將DBP、BBP、DEHP、DEP等多種PAEs列為優(yōu)先控制污染物[6].

PAEs很難降解，在自然環(huán)境中通過水解、光解的速率非常緩慢.處理PAEs 污染物的現(xiàn)有技術(shù)主要有吸附、光化學氧化、生物降解等.吸附法和光化學氧化法成本高，且容易造成二次污染.微生物降解是自然界中PAEs去除的主要方式，具有清潔經(jīng)濟的特點，得到科研人員的廣泛關(guān)注[7].DBP作為最常用的PAEs，許多研究人員從環(huán)境中篩選DBP的降解菌.已報道的DBP降解菌普遍降解濃度較低，僅在mg·L-1水平，且降解其他(如長鏈)PAEs的效率不高[8-9]，因此有必要篩選出降解能力更強、降解條件和底物范圍更廣的DBP降解菌，以提高微生物在降解PAEs中的應(yīng)用價值.

本研究從土壤中篩選到能夠高效降解DBP的菌株，通過生理生化以及16S rDNA等將其鑒定為寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonassp.)，并測試其底物范圍及探究降解DBP的條件、降解動力學，可為PAEs的污染治理提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 材料

土樣采自福建省福州市晉安區(qū)新店鎮(zhèn)紅廟嶺垃圾綜合處理場.試劑：DBP、DEHP、DMP、BBP、DEP、苯胺、甲苯和鄰苯二甲酸、三氯甲烷(均為分析純)、甲醇(色譜純/分析純)均購自國藥試劑有限公司 ；用水為超純水 其余無機鹽試劑均為分析純.

基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)基(mineral salt medium，MSM)(成分的單位：g·L-1)：K2HP045.8 g，KH2P044.5 g，(NH4)2S042.0 g，MgCl20.16 g，CaCl20.02 g，Na2MoO4·2H2O 0.002 4 g，F(xiàn)eCl30.001 8 g，MnCl2·2H2O 0.001 5 g，pH 7.0.121℃高壓滅菌20 min.

底物培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基是在試管中加入甲醇溶解的DBP、DEHP、DMP、BBP、DEP、苯胺、甲苯和鄰苯二甲酸母液，水浴加熱使甲醇蒸發(fā)，待甲醇完全蒸發(fā)后再加入MSM配制成所需濃度的各類底物液體培養(yǎng)基.DBP固體培養(yǎng)基是DBP液體培養(yǎng)基加2%的瓊脂.121℃高壓滅菌20 min.

1.2 降解菌的篩選

稱取土樣5 g于100 mL 含5%的DBP液體培養(yǎng)液中，采用10%、15%、20%的DBP濃度梯度壓力法馴化，30 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，再轉(zhuǎn)接2 mL菌液至下一濃度梯度的DBP液體培養(yǎng)基培養(yǎng).20%的DBP的菌液進行梯度稀釋104倍后涂布于DBP固體平板上，30 ℃有氧恒溫培養(yǎng)，通過劃線在DBP固體平板上反復(fù)純化，重復(fù)多次，直至菌落形態(tài)單一.挑取單菌落，在LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基中富集培養(yǎng).

1.3 降解菌的分子生物學鑒定

用細菌基因組脫氧核糖核酸(DNA)提取試劑盒(OMEGA公司)提取細菌的總DNA，以其為模板，用16S rDNA特異性引物27F與1492R，進行16S rDNA擴增.

聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測序.將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中Blastn 程序進行序列同源性檢索和比對，并通過MEGA7.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，分析確定該菌的分類地位.

1.4 PAEs的測定

采用高效液相色譜法(HPLC)測定PAEs含量：將菌體與液體培養(yǎng)基8000 r·min-1離心3 min.用三氯甲烷分別對菌和液體進行兩次萃取得到PAEs，待三氯甲烷揮發(fā)后，加入甲醇定容至5.0 mL.用孔徑為0. 22 μm的有機相過濾器過濾后，用高效液相色譜儀(DGC-20A3R型，島津公司)測定液體中PAEs的含量.

HPLC分析條件：色譜柱Agilent?ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm×5 μm)，柱溫35℃，流動相甲醇與水體積比為90∶10，流速為0.5 mL·min-1，檢測器波長為228 nm，進樣量為20 μL.利用HPLC測定PAEs的殘留量.

1.5 生長量的測定

取菌液1 mL，離心分離，用MSM重懸菌液，紫外分光光度計(T6系列，上海普析通用儀器有限責任公司)測OD600，即為菌株的生長量.

1.6 底物特異性

挑取在DBP固體培養(yǎng)基中生長良好的單菌落，置于LB液體培養(yǎng)基中30 ℃，175 r·min-1培養(yǎng)10 h.離心收集菌體、重懸，配制菌體濃度OD6000.1.無菌條件下，吸取菌液，接種量于4 mL，8種10 g·L-1液體底物(DBP、DEHP、DMP、BBP、DEP、苯胺、甲苯和鄰苯二甲酸)培養(yǎng)基中，pH 7、30 ℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)5 d.紫外分光光度計測定生長量，高效液相色譜法分析8種底物的殘留量.

1.7 DBP降解條件的優(yōu)化

分別探究不同的DBP初始濃度、pH、溫度、搖床轉(zhuǎn)速及葡萄糖添加量在72 h內(nèi)對菌生長和降解DBP的影響.所有實驗數(shù)據(jù)均為三次平行實驗的平均值，數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行分析，圖中誤差線為三次平行實驗的標準差.

1.8 降解動力學

分別探究初始質(zhì)量濃度為1、5、10、20、50 g·L-1的DBP，在最佳培養(yǎng)條件下，每隔8 h測定72 h內(nèi)DBP的殘留量，每個樣品設(shè)置三組平行.用軟件GraphPad Prism5.0(GraphPad Software, Inc, USA)擬合實驗數(shù)據(jù)，構(gòu)建降解動力學模型，得出B3降解DBP的半衰期和速率常數(shù).直觀體現(xiàn)出時間和PAEs殘留量的關(guān)系以及降解速率的變化.進一步研究出B3的降解DBP的特性，完善微生物降解PAEs有機污染物的研究.一級動力學模型可用方程表示：Y=(Y0-rPla)·e-Kt+rPla，Y表示DBP的質(zhì)量濃度,g·L-1;Y0為初始質(zhì)量濃度，g·L-1；rPla為無限時間后DBP殘留質(zhì)量濃度，g·L-1；K為速率常數(shù)，半衰期t1/2= ln 2/K，初始降解速率v0= dY/dt=(Y0-rPla)·K·e-Kt，t→0.v0的單位為g·L-1·h-1.

2 結(jié)果與討論

2.1 降解菌的鑒定

經(jīng)過富集培養(yǎng)，分離得到一株能夠在以DBP為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長良好的菌，命名為B3.觀察菌落形態(tài)并通過結(jié)晶紫簡單染色觀察細菌，發(fā)現(xiàn)菌落呈黃綠色不透明，中等大小，表面粘稠，邊緣平整，規(guī)則圓形，表面隆起，細長桿狀.

擴增得到B3的16S rDNA序列，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖1)，B3與寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonassp. KX928046.1)聚為一支，相似性為99%，同時結(jié)合該菌株的菌落形態(tài)特征，判定其為寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonassp.).據(jù)報道，寡養(yǎng)單胞菌能降解甲基對硫磷[10]、雙對氯苯基三氯乙烷(DDT)有機農(nóng)藥[11]和四環(huán)素[12]等有機污染物，本研究篩選得到的能降解PAEs的寡養(yǎng)單胞菌為首次發(fā)現(xiàn).

圖1 B3的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.1 Phylogenetic analysis of strain B3

2.2 底物特異性

將B3分別接種于如表1所示的8種10 g·L-1底物液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d后檢測菌株的生物量(OD600)及底物的殘留量，計算降解率.

B3在8種底物培養(yǎng)基中均能生長，其中在短鏈的PAEs(DBP 、BBP、DMP)以及苯胺中生長較好(OD600>0.8)，而在長鏈PAE(DEHP)中生長較慢，這種差異可能是由于各類PAEs側(cè)鏈不同所引起的[8-9].B3對8種底物的降解率均在50%及以上，其中對BBP(90.1%)和苯胺(89.0%)的降解率最高，其次是DBP(75.9%)和DMP(73.0%).這表明B3的底物特異性不明顯，能夠降解多種PAEs及芳香類化合物.與B3類似，許多已報道的DBP降解菌更容易利用短鏈的PAEs，而對長鏈PAEs如DEHP的降解效果不佳：如Gordoniasp. strain QH-11[13-14]降解DEP和DBP的效果比長鏈的DMP、 DIOP、 DEHP的好；Camelimonassp. M11[15]降解DPP、DEP、DBP的效率依次遞減.B3降解10 g·L-1的長鏈DEHP的能力雖不比短鏈的好，但降解率仍有60%以上.

2.3 降解條件優(yōu)化

首先探究底物DBP的初始濃度對B3生長和降解率的影響(表2).表中，培養(yǎng)條件：pH為7，30 ℃，175 r·min-1，初始菌濃度OD600為0.05，反應(yīng)時間為72 h.隨著底物濃度增加，B3生長量在增長，當質(zhì)量濃度大于10 g·L-1，呈緩慢下降趨勢，表明B3對DBP具有很強的耐受性.DBP質(zhì)量濃度為0.05 g·L-1時，降解率為93.4%，DBP濃度提高，降解率緩慢下降，可能是由于底物過剩，或是DBP本身具有毒性，隨著其濃度增加對菌的抑制作用增強.當DBP質(zhì)量濃度小于等于10 g·L-1時，B3降解DBP的效率均大于75%.當DBP質(zhì)量濃度在20 g·L-1及以上時，降解率仍維持在70%左右.許多報道也研究了不同濃度DBP對菌的降解的影響：He[8]和Jin[13]等分別研究了0.6～1.2 g·L-1和0.1～0.75 g·L-1質(zhì)量濃度范圍的DBP對菌降解的影響.B3降解DBP濃度范圍較前人的寬，而且效率高.表2中，生長量以O(shè)D600表示(下同).

表1 B3的底物特異性Tab.1 Substrate specificity of strainB3

表2 DBP初始濃度對B3菌株降解的影響Tab.2 Effect of initial DBP concentrations on the degradation efficiency by B3

在10 g·L-1DBP初始質(zhì)量濃度下，探究pH、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、接菌量和葡萄糖濃度對B3生長和降解DBP的影響(圖2、表3).圖2顯示，B3的生長量和降解率呈現(xiàn)正相關(guān).圖2a顯示，30 ℃條件下，B3在pH為5～11，B3對10 g·L-1DBP的降解率保持在60%以上，當pH由7上升至8時， B3的降解率由75.9%提高至92.2%，說明弱堿性的環(huán)境有利于B3對DBP的降解.Wu等[16]篩選出的Ochrobactrumsp. JDC-41在 pH小于5或pH高于9，DBP降解率驟降至2%～35%.而B3在pH小于6或高于9的條件下，對DBP的降解率都超過60%，表明B3降解DBP受pH影響相對較小.

在pH 8的條件下探究溫度對B3降解DBP的影響(圖2b).不同溫度下菌株的生長量和降解率不同，這可能與菌體內(nèi)酶的活性有關(guān).20 ℃～45 ℃時，B3降解率均在60%以上，其中在25 ℃～35 ℃降解率大于80%，35 ℃時降解率最高，為94.1%.B3在溫度40 ℃及以上時，對10 g·L-1DBP仍具有70%以上的降解率，這與報道的降解DBP的eBrucellaceae、Sinobacteraceae[7]等菌株不同，這些菌降解的最適溫度均在30 ℃～35 ℃間，但溫度大于40 ℃或低于25 ℃時，降解活力大大降低.

圖2c搖床的轉(zhuǎn)速反映了對B3降解DBP過程中的溶解氧的供給量，溶解氧供給量不足或是過量，好氧微生物的生長與代謝均會受影響.轉(zhuǎn)速過低通氣量不足，菌株的生長和降解效果不佳；隨著轉(zhuǎn)速提升，B3生長和降解速率增加，在轉(zhuǎn)速175 r·min-1時B3菌株的生長量達到最高、降解DBP的效果最佳.轉(zhuǎn)速高于175 r·min-1時，生長量和降解率均有所降低.Wu等[17]發(fā)現(xiàn)Gordoniasp.降解DBP的最佳搖床轉(zhuǎn)速為175 r·min-1，而轉(zhuǎn)速大于或小于175 r·min-1時，B3對DBP的降解效果降低，本文與該結(jié)果相似.與本文不同的是，Gordoniasp菌在75 r·min-1時，對0.4 g·L-1的DBP降解率只有20%左右，而B3在靜置培養(yǎng)時，降解率仍有60%.

a pH

b 溫度

c 轉(zhuǎn)速

d 接菌量

葡萄糖質(zhì)量濃度/(g·L-1)00.250.50.7511.251.5生長量1.5 ± 0.22.0 ± 0.12.6 ± 0.14.3 ± 0.15.2 ± 0.1 5.5 ± 0.15.9 ± 0.1降解率/%95.8 ± 0.5 62.1 ± 2.465.9 ± 0.994.2 ± 0.295.1 ± 0.195.8 ± 1.795.9 ± 1.8

注：培養(yǎng)條件：pH 8，35 ℃，175 r·min-1，DBP質(zhì)量濃度為10 g·L-1，接菌量OD6000.05，反應(yīng)時間為72 h

由圖2d可知接菌量OD600小于0.125時，降解率和B3的生長量上升顯著，當接菌量OD600大于0.25時，降解率和生長量提高不明顯.接菌量OD600為0.05至0.25時，B3菌對10 g·L-1的DBP的降解率超過94.3%.

探究葡萄糖添加量對B3降解的影響(表3)，發(fā)現(xiàn)葡萄糖添加量≤0. 5 g·L-1時，對B3降解DBP有抑制作用.葡萄糖對于許多微生物而言是良好的碳源，微生物在含葡萄糖的條件下為了優(yōu)先利用葡萄糖，會抑制其他碳源的代謝[18].Jin 等[19]也探究了葡萄糖添加量對菌株降解DBP的影響，結(jié)果顯示低濃度的葡萄糖抑制菌株對DBP的降解，這與本文結(jié)果相同.上述研究還表明高濃度的葡萄糖對菌降解DBP有促進作用，這與本文不同.因此得到結(jié)論，在B3降解DBP過程中沒有必要添加葡萄糖.綜上，B3降解10 g·L-1DBP的最佳pH為8，溫度35 ℃, 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為175 r·min-1，接菌量OD600為0.125，在72 h內(nèi)降解效率可達95.8%.

2.4 DBP的降解動力學

在最佳培養(yǎng)條件下，設(shè)置DBP初始質(zhì)量濃度為1、5、10、20、50 g·L-1，每隔8 h測定DBP的殘留量，以GraphPad Prism5進行數(shù)據(jù)擬合(圖3，表4)，探究B3菌對DBP的降解動力學.

圖3 B3降解不同初始質(zhì)量濃度DBP的降解曲線Fig.3 DBP degradation profiles at different DBP initial concentrations

實驗結(jié)果表明，B3降解DBP符合一級動力學模型，降解速率與DBP初始濃度密切相關(guān).初始濃度的增加，初始降解速率增大，當初始質(zhì)量濃度為50 g·L-1時，初始降解速率可達1.25 g·L-1·h-1.DBP質(zhì)量濃度小于等于10 g·L-1時，隨DBP的濃度增大，半衰期縮短，降解速率常數(shù)增大；DBP質(zhì)量濃度為10 g·L-1，降解速率常數(shù)達到最大(K=0.064)，半衰期最短(t1/2=10.8 h)；當DBP質(zhì)量濃度為50 g·L-1時，半衰期增大，降解速率常數(shù)減小.一級動力學常用于有機污染物的降解動力學[20]，He等[9]報道的赤紅球菌屬(Rhodococcusruberstrain)，當DBP質(zhì)量濃度小于等于0.8 g·L-1時，初始濃度的增加，降解速率增大，半衰期縮短；DBP質(zhì)量濃度高于0.8 g·L-1時，隨濃度增大，降解速率降低，半衰期增大，這些結(jié)果與本文結(jié)果相同.

表4 不同初始濃度DBP的降解動力學方程Tab.4 Degradation kinetics equation of DBP with different initial concentration

近年來，探尋綠色高效經(jīng)濟的降解PAEs的方法已成為研究熱點，已有很多報道降解DBP的菌屬(表5).許多研究報道的PAEs的降解率雖然可達90%，但降解的濃度通常在mg·L-1級別[21-22].Tang等[22]報道的根瘤菌(Rhizobiumsp.)降解50 mg·L-1的效率大于90%，而當濃度升高時，降解率大大降低，當DBP質(zhì)量濃度為400 mg·L-1時，降解率僅為50%左右.而在Chen等[15]報道中Camelimonassp.在336h內(nèi)降解0.03～0.14 g·L-1DBP的效率不高于56%.在有些DBP降解濃度較高的報道中，菌降解時間長、效率不高亦或需要多種菌的共同作用：Kumar等[14]報道的假單胞菌屬(Pseudomonassp.)和叢毛單胞菌屬(Comamonassp.)在192 h內(nèi)分別降解2 g·L-1DBP的效率僅為57%、46%.本文篩選到的寡養(yǎng)單胞菌B3不僅在寬的濃度范圍內(nèi)保持著高效降解能力，而且降解的底物范圍、溫度、pH范圍等條件均較寬.

表5 不同的DBP降解菌的降解特性Tab.5 Degradation characteristics of different PAEs by degrading bacteria

3 結(jié)論

本文篩選到的PAEs降解菌——寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonassp.)B3菌株，其對DBP的作用濃度和條件范圍廣.在30℃，pH 7條件下，B3在72 h內(nèi)，對0.05～0.5 g·L-1DBP的降解率在86%以上，降解0.05 g·L-1DBP 的效率為93.4%.在35 ℃、pH 8 條件下，B3對1～50 g·L-1DBP的降解率在72%以上，初始降解速率高，當DBP質(zhì)量濃度在5 g·L-1及以上時，降解率仍維持在80%左右，降解濃度高且高效降解濃度范圍寬.在20 ℃～45 ℃的溫度及pH 5～11的范圍中，B3菌株對10 g·L-1DBP降解率保持在60%以上.在pH 8，35 ℃，175 r·min-1，接菌量OD600為0.125的條件下，對10 g·L-1DBP的降解在72 h內(nèi)可達到95.8%.B3降解DBP符合一級動力學模型.B3不僅對DBP具有高效的降解效果，而且對DEHP、BBP、DEP、DMP、苯胺、甲苯和鄰苯二甲酸的降解率均在50%及以上，其中對BBP、苯胺的降解效果在88%以上.B3菌寬的降解濃度和底物種類范圍預(yù)示著該株寡養(yǎng)單胞菌在PAEs的生物修復(fù)中具有獨特的應(yīng)用價值.