NaN3和紫外線復(fù)合誘變對(duì)苜蓿愈傷組織在干旱和鹽脅迫下生長(zhǎng)的影響

李 波，林 浩，鄔婷婷，陳雪梅

(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

苜蓿(MedicagosativaL.)是多年生的豆科類草本植物，具有產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的特性，被世界公認(rèn)為優(yōu)質(zhì)牧草之一[1]。由于近幾年環(huán)境干旱和土地鹽漬化的加劇，導(dǎo)致紫花苜蓿的種植面積逐年減少, 嚴(yán)重威脅其產(chǎn)量，因此，亟待加強(qiáng)培育抗逆性強(qiáng)的苜蓿新品種，以豐富我國(guó)匱乏的苜蓿種質(zhì)資源。

植物耐鹽和抗旱機(jī)制是錯(cuò)綜復(fù)雜的, 耐鹽和抗旱性狀是受多基因控制的, 涉及多種生理代謝途徑。為了獲得抗逆性強(qiáng)的苜蓿新品種，評(píng)價(jià)耐鹽和抗旱突變材料生理生化功能上的差別，采用理化誘變因素復(fù)合處理的方法開(kāi)展耐逆紫花苜蓿研究，以期獲得優(yōu)良農(nóng)藝性狀的新種質(zhì)材料，對(duì)紫花苜蓿耐鹽和抗旱育種及生理機(jī)制研究有一定參考價(jià)值，有利于豐富我國(guó)苜蓿的品種資源，推動(dòng)苜蓿產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以圖牧2號(hào)苜蓿無(wú)菌苗的下胚軸誘導(dǎo)出的愈傷組織為材料，由齊齊哈爾大學(xué)植物組織培養(yǎng)研究室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 愈傷組織的繼代培養(yǎng) 將淡黃色、松嫩的愈傷組織切割成0.5 cm3左右的小塊，轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中，繼代2～3次的愈傷組織即可作為誘變和脅迫的材料。繼代培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1 mg·L-1+ 6-BA 0.5 mg·L-1+ 30 g蔗糖+8.5 g瓊脂(pH=5.8)。

1.2.2 NaN3和紫外線誘變半致死濃度(劑量)選擇 用磷酸緩沖液(pH=7.0，0.2 M)配置濃度為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0×10-3mol·L-1和5.5×10-3mol·L-1的NaN3溶液，將愈傷組織置于NaN3溶液中,低速搖床震蕩4 h后無(wú)菌水沖洗3次，愈傷組織轉(zhuǎn)接在繼代培養(yǎng)基，每個(gè)梯度約120塊愈傷組織(每塊約0.5 cm3),25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25 d。

選取30 W的紫外燈管，以20 cm的距離和不同的照射時(shí)間(2、3、4、5、6、7 min和8 min)為紫外線的誘變劑量，每個(gè)梯度處理約90塊愈傷組織，避光黑暗25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25 d。

1.2.3 NaCl和PEG脅迫致死濃度的篩選 將愈傷組織切割成0.5 cm3左右小塊，接種在含有不同濃度的PEG-6000液體培養(yǎng)基中，PEG脅迫的濃度梯度為0%、15%、20%、25%和30%，每個(gè)梯度處理約90塊愈傷組織，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在2、4、6、8 d和10 d將其轉(zhuǎn)接到MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

將愈傷組織切割成0.5 cm3左右小塊，轉(zhuǎn)接至NaCl梯度培養(yǎng)基中(NaCl濃度為0.5%、1.0%、1.5%和2.0%)，每種鹽濃度處理約90塊愈傷組織，25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d。

1.2.4 復(fù)合誘變后愈傷組織的干旱、鹽脅迫 將復(fù)合誘變處理后生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接在含NaCl和PEG的致死濃度培養(yǎng)基中，分別脅迫處理8 d和10 d，存活的愈傷組織繼代培養(yǎng)。繼代兩次后，將NaCl處理的部分愈傷組織轉(zhuǎn)入含PEG的致死培養(yǎng)基中，進(jìn)行脅迫處理10 d，存活的愈傷組織繼代培養(yǎng)。

1.2.5 生理生化指標(biāo)的測(cè)定 游離脯氨酸含量測(cè)定采用茚三酮法，丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮法，過(guò)氧化氫酶活性(CAT)測(cè)定采用紫外吸收法。

1.3 愈傷組織存活率和愈傷組織致死率的測(cè)定

愈傷組織存活率(%)=愈傷組織存活(塊)數(shù)/接種愈傷組織總(塊)數(shù)×100%

愈傷組織的致死率(%)=愈傷組織死亡(塊)數(shù)/接種愈傷組織總(塊)數(shù)×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Execl 2003、SPSS 17.0對(duì)所測(cè)定的各項(xiàng)生理指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，比較各項(xiàng)生理指標(biāo)變化的差異及顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaN3和紫外線誘變對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響

2.1.1 NaN3誘變 苜蓿愈傷組織對(duì)NaN3誘變劑比較敏感，經(jīng)過(guò)不同濃度的NaN3誘變后，其生長(zhǎng)受到顯著的影響(見(jiàn)圖1)，表現(xiàn)出隨NaN3濃度的增加，愈傷組織受損傷程度加重，其生活力明顯降低，愈傷組織色澤由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色，甚至為褐色。NaN3濃度與愈傷組織存活率間呈負(fù)相關(guān)性(見(jiàn)表1)，在誘變后培養(yǎng)初期(前5 d)愈傷組織無(wú)明顯變化，第10天左右隨著NaN3濃度的增加愈傷組織逐漸褐化死亡。培養(yǎng)至25 d時(shí)，隨著NaN3誘變濃度的增加，愈傷組織的致死率增加，4.0×10-3mol·L-1NaN3處理組的致死率為50.83%，此濃度為NaN3的LG50，NaN3濃度為5.5×10-3mol·L-1處理組致死率為95.83%，此濃度為NaN3的LC100，LC50為愈傷組織死亡近一半的NaN3濃度，LC100為愈傷組織近全部死亡的NaN3濃度。

2.1.2 紫外線誘變 苜蓿愈傷組織經(jīng)過(guò)不同劑量紫外線誘變后，其生長(zhǎng)狀態(tài)受到一定的影響(見(jiàn)圖2)，表現(xiàn)出隨紫外線劑量的增加，愈傷組織存活率逐漸下降。在誘變初期(前5 d)愈傷組織無(wú)明顯變化，第10天左右隨著紫外線輻射劑量的增加愈傷組織逐漸褐化死亡(見(jiàn)表2)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，各誘變處理組死亡率提高。處理時(shí)間大于6 min，愈傷組織表現(xiàn)為生活力明顯降低，色澤由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色，甚至成為褐色，存活率大大下降。紫外線輻射與愈傷組織存活率呈負(fù)相關(guān)，愈傷組織培養(yǎng)至25 d時(shí)，隨著紫外線誘變劑量的增加，愈傷組織的致死率逐漸增加，6 min處理組的致死率為51.11%，此劑量為紫外線的LC50，8 min處理組致死率達(dá)到96.67%，此劑量為紫外線的LD100。

2.1.3 復(fù)合誘變下苜蓿愈傷組織生長(zhǎng)狀況 苜蓿愈傷組織經(jīng)過(guò)復(fù)合誘變處理后，其生長(zhǎng)狀況受到明顯的抑制，愈傷組織存活率降低(見(jiàn)圖3)。復(fù)合誘變處理前6 d愈傷組織顏色變淡，沒(méi)有生長(zhǎng)活力，培養(yǎng)至15 d左右，部分愈傷組織開(kāi)始緩慢恢復(fù)生長(zhǎng)(見(jiàn)圖4)，20 d時(shí)部分存活下來(lái)逐漸生長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至25 d時(shí)，愈傷組織顏色逐漸轉(zhuǎn)為淡綠色，旺盛生長(zhǎng)。

注：1～10為NaN3濃度為0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5×10-3 mol·L-1的愈傷組織。Notes：1～10 was callus under NaN3concentration of 0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5×10-3 mol·L-1.圖1 不同濃度NaN3誘變苜蓿愈傷組織Fig1 Alfalfa callus induced by different concentrations of NaN3

表1 NaN3誘變苜蓿愈傷組織生長(zhǎng)狀況Table 1 The growth status of alfalfa callus induced by NaN3 mutagenesis

注：1～8為紫外線照射不同時(shí)間(0，2，3，4，5，6，7 min和8 min)苜蓿愈傷組織。Notes：1～8 was callus of UV irradiation for different time( 0，2，3，4，5，6，7 min and 8 min).圖2 紫外線輻射苜蓿愈傷組織Fig 2 Alfalfa callus under ultraviolet radiation

表2 紫外線輻射苜蓿愈傷組織生長(zhǎng)狀況Table 2 Growth status of alfalfa callus after ultraviolet radiation

圖3 復(fù)合誘變愈傷組織的存活率Fig.3 The survival rate of callus by hybrid mutagenesis

圖4 復(fù)合誘變苜蓿愈傷組織Fig.4 Alfalfa callus by hybrid mutagenesis

圖5 NaCl脅迫下愈傷組織的存活率Fig.5 The survival rate of callus under NaCl stress

2.2 NaCl和PEG脅迫對(duì)愈傷組織存活率和生長(zhǎng)狀況的影響

NaCl脅迫下苜蓿愈傷組織存活率的變化見(jiàn)圖5,生長(zhǎng)狀況見(jiàn)圖6。隨著鹽濃度的增加和處理時(shí)間的增加苜蓿愈傷組織的存活率逐漸降低，在NaCl脅迫處理10 d和濃度為1.0%時(shí)、8 d和濃度1.5%時(shí)，愈傷組織存活率分別為53.96%、54.31%，均達(dá)到NaCl的LC50，在NaCl脅迫處理12 d和濃度為2.0%時(shí)，愈傷組織存活率達(dá)到最低，為17.45%，褐化率最高，此濃度為NaCl的LC100。

PEG脅迫苜蓿愈傷組織生長(zhǎng)狀況見(jiàn)圖7，愈傷組織存活率的變化見(jiàn)圖8。隨著PEG濃度的增加及處理天數(shù)的增加苜蓿愈傷組織的存活率逐漸降低，在PEG脅迫6 d和濃度為25%時(shí)，存活率為48.10%，此濃度為PEG的LC50，在PEG脅迫10 d和濃度為30%時(shí)，其存活率最低，為3.80%，此濃度為PEG的LC100。

2.3 復(fù)合誘變對(duì)干旱和鹽脅迫下苜蓿愈傷組織存活率的影響

復(fù)合誘變和混合高鹽及干旱脅迫下苜蓿愈傷組織生長(zhǎng)狀況見(jiàn)圖9，愈傷組織的存活率變化見(jiàn)圖10。經(jīng)復(fù)合誘變的PEG脅迫、復(fù)合誘變的NaCl脅迫、復(fù)合誘變的PEG和NaCl脅迫處理后的苜蓿愈傷組織，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加其存活率下降，直到15～18 d時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)趨于穩(wěn)定，經(jīng)復(fù)合誘變的PEG和NaCl處理下的愈傷組織存活率最低，為16%。

注：1～5為0，0.5%，1.0%，1.5%和2%濃度NaCl處理的愈傷組織。Note：1～5 was callus under NaCl concentration of 0，0.5%，1.0%，1.5% and 2%.圖6 NaCl脅迫下苜蓿的愈傷組織Fig. 6 Alfalfa callus under NaCl stress

注：1～5為0，15%，20%，25%和30%濃度PEG處理的愈傷組織。Notes：1～5 was callus under PEG concentration of 0，15%，20%，25% and 30%.圖7 PEG脅迫下苜蓿的愈傷組織Fig.7 Alfalfa callus under PEG stress

圖8 PEG脅迫下愈傷組織的存活率Fig.8 Survival rate of callus under PEG stress

注：1.復(fù)合誘變(LC50)+PEG(LC100);2.復(fù)合誘變(LC50)+NaCl(LC100);3.復(fù)合誘變(LC50)+PEG(LC100)+NaCl(LC100)。Notes：1. hybrid induced(LC50)+PEG(LC100);2. hybrid induced (LC50)+NaCl(LC100);3. hybrid induced (LC50)+PEG(LC100)+NaCl(LC100).圖9 復(fù)合誘變及鹽和干旱脅迫下苜蓿愈傷組織Fig.9 Alfalfa callus under hybrid mutagenesis and stress of salt and drought

圖10 復(fù)合誘變及鹽和干旱脅迫下愈傷組織的存活率Fig.10 Survival rate of callus under hybrid mutagenesis and stress of salt and drought

2.4 誘變和脅迫處理苜蓿愈傷組織的生理變化

經(jīng)脅迫和誘變苜蓿愈傷組織的脯氨酸、可溶性糖、丙二醛的含量及CAT酶活性的變化見(jiàn)表3，脅迫和誘變處理與對(duì)照比較提高了脯氨酸、可溶性糖和CAT酶活性，降低了丙二醛的含量。NaCl和PEG脅迫脯氨酸比對(duì)照增加了55.36%和41.88%，可溶性糖比對(duì)照增加了52.15%和37.12%，CAT酶活性比對(duì)照增加了7.58%和5.77%，丙二醛含量比對(duì)照降低了30.66%和25.23%。在三種誘變處理中，NaN3誘變后的脯氨酸、可溶性糖含量和CAT酶活性分別比對(duì)照增加了59.77%、77.91%和9.61%,丙二醛含量比對(duì)照降低了40.48%；紫外線誘變后的脯氨酸、可溶性糖含量和CAT酶活性分別比對(duì)照增加66.75%、105.83%和9.72%,丙二醛含量比對(duì)照降低了44.56%；NaN3+紫外線混合誘變后的脯氨酸、可溶性糖含量和CAT酶活性分別比對(duì)照增加155.31%、258.90%和21.14%，丙二醛含量比對(duì)照降低了64.20%。三種誘變方式中，混合誘變愈傷組織脯氨酸、可溶性糖及CAT酶活性均最高，丙二醛含量最低。在混合誘變中，NaCl、PEG和NaCl+PEG混合脅迫比較，NaCl+PEG混合脅迫愈傷組織脯氨酸、可溶性糖及CAT酶活性均最高，丙二醛含量最低，NaN3+紫外線混合誘變處理提高了苜蓿愈傷組織對(duì)鹽和干旱的抵抗能力。

表3 誘變及干旱和鹽脅迫下苜蓿愈傷組織的生理和生化指標(biāo)的變化Table 3 Changes of physiological and biochemical indexes under mutagenesis and stress

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Note：Different letters indicate significant difference (P<0.05), and the same letters indicate no significant difference (P>0.05).

3 討 論

3.1 復(fù)合誘變效應(yīng)

單一因素雖能引起某些植物性狀的突變，但誘變效果還不夠理想，誘變譜也比較單純，為了提高誘變育種效果，理化因素復(fù)合誘變處理受到廣泛關(guān)注。由于射線改變了生物膜的完整性和滲透性，從而有助于化學(xué)誘變劑的吸收[4-6]。物理和化學(xué)因素的復(fù)合處理，可以產(chǎn)生累加效應(yīng)，提高突變頻率和誘變效果。多數(shù)試驗(yàn)證實(shí)了復(fù)合處理增加誘變效應(yīng)的可能性。付鳳玲等[8]用射線輻射和NaN3處理玉米愈傷組織，在含1.0% NaCl的高滲培養(yǎng)基上篩選，對(duì)再生植株株系進(jìn)行耐鹽性鑒定。結(jié)果表明，20 Gy的輻射和1 mmol·L-1NaN3是較為適合玉米愈傷組織誘變的處理組配，22個(gè)再生植株株系中有5個(gè)誘變株系的耐鹽性高于未誘變對(duì)照。鹿巍[9]采用紫外線及化學(xué)誘變EMS的方法對(duì)小麥葉銹菌菌株05-5-46的單胞菌系進(jìn)行誘變，得到的4株小麥葉銹菌突變菌株為新的致病類型。本研究發(fā)現(xiàn)不同的誘變處理方法，可以影響苜蓿愈傷組織的存活率，且在一定的NaN3和紫外線誘變下，存活的愈傷組織增加其對(duì)NaCl和PEG的抵抗能力，說(shuō)明紫外線和NaN3復(fù)合誘變可提高苜蓿愈傷組織的誘變效應(yīng)。

3.2 復(fù)合誘變對(duì)苜蓿愈傷組織生理和生化水平的影響

從脯氨酸、可溶性糖含量和CAT活性的變化來(lái)看，這三項(xiàng)指標(biāo)變化情況一致，經(jīng)復(fù)合誘變處理后，三項(xiàng)指標(biāo)均有大幅度增加，說(shuō)明理化復(fù)合誘變可以增強(qiáng)某些生理生化指標(biāo)的含量，來(lái)提高機(jī)體的抵抗能力[10-11]。單一化學(xué)誘變處理或物理誘變使三項(xiàng)指標(biāo)的含量均小幅上升，而丙二醛的含量經(jīng)復(fù)合誘變處理含量的下降趨勢(shì)也要高于單因素誘變，這說(shuō)明理化復(fù)合誘變對(duì)苜蓿愈傷組織的影響較大，這可能與理化復(fù)合誘變的特性有關(guān)。

為了適應(yīng)誘變后鹽和干旱脅迫，植物體內(nèi)存在的抗氧化酶系統(tǒng)包括過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等可以緩解因逆境帶來(lái)的傷害[12]。CAT酶是生物體內(nèi)的主要抗氧化酶，它能促進(jìn)細(xì)胞中過(guò)氧化氫的分解，減輕過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞的損害，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苜蓿愈傷組織經(jīng)誘變脅迫處理后，特別是復(fù)合誘變+NaCl+PEG處理苜蓿愈傷組織CAT活性大大提高。

復(fù)合誘變+PEG+NaCl處理均高于紫外線+NaCl+PEG和NaN3+NaCl+PEG處理，表明復(fù)合誘變苜蓿愈傷組織的抗性比單一因素誘變愈傷組織的抗性強(qiáng)。理化復(fù)合誘變處理對(duì)苜蓿愈傷組織的影響較為復(fù)雜，但總體表現(xiàn)出理化復(fù)合誘變+PEG+NaCl處理對(duì)誘變起著主導(dǎo)性的作用，這說(shuō)明理化復(fù)合誘變處理的誘變效果強(qiáng)于單因素誘變，能提高苜蓿愈傷組織的抗逆性，這可能與復(fù)合誘變處理的多方向性和不定向性有關(guān)。