黑鯛×真鯛雜交子代與真鯛的Calmodulin基因克隆與表達分析

陳淑吟，張志勇，吉紅九，李 鵬，趙永超，張志偉

（1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇南通 226007；2.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京 210023）

鈣調蛋白也稱鈣調素（calmodulin，CaM），是真核細胞中最重要的 Ca2＋結合蛋白［1－2］。作為Ca2＋信號傳導途徑中的主要信號轉導分子，CaM介導調控由Ca2＋引起的一系列生理生化反應，對細胞增殖、神經(jīng)傳導、激素分泌、基因表達等重要的生理過程具調節(jié)功能［3－6］。關于CaM基因與物種的生長、生殖等經(jīng)濟性狀相關的研究已有不少報道，如CaM基因座可能是影響京海黃雞新品種產(chǎn)蛋數(shù)和蛋殼質量性狀重要候選基因［7］；CaM與三疣梭子蟹（Portunus trituberculatu）生長蛻皮［8］有密切關系；參與對貝類外殼形成的調控［9－11］，CaM一些位點突變對長牡蠣（Crassostrea gigas）貝殼重有顯著性影響［12］；CaM的上調表達與魚類的抗寒能力有關［13］；RNAi實驗顯示出CaM對血吸蟲（Schistosoma mansoni）幼蟲早期發(fā)育的 重 要 作 用［14］。此 外，在 赤 點 石 斑 魚（Epinephelus akaara）雌性轉雄性過程中，CaM是促使性轉變的重要功能基因之一［15］；莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）體內(nèi)的類固醇生成受 Ca2＋／CaM調節(jié)［16］。這些研究表明 CaM基因在物種的生長發(fā)育與性腺發(fā)育等過程中扮演重要作用。

真鯛 （Pagrus major）、黑鯛 （Acanthopagrus schlegelii）分別為鯛科（Sparidae）的赤鯛屬和棘鯛屬中名貴經(jīng)濟魚類，黑鯛肉質細膩、味道鮮美又有較好抗逆性，真鯛生長速度快且體色靚麗，均是中國不同海區(qū)的重要養(yǎng)殖對象［17－18］。為選育優(yōu)良海水養(yǎng)殖新品種，利用黑鯛與真鯛進行的雜交育種已有不少研究［19－21］；關于黑鯛、真鯛及雜交子代（F1）的核型、遺傳相似性、抗逆性或營養(yǎng)成分比較等方面已有一些報道［22－25］，而尚未有從功能基因上進行相關研究的報道。近年來，通過篩選出與雜種優(yōu)勢形成有關的基因，揭示基因表達差異正成為探尋雜種優(yōu)勢分子機理新的切入點［26］。由黑鯛（♂）×真鯛（♀）中得到的雜交子代F1（AP），1～2齡魚的生長速度已顯示了較好的雜種優(yōu)勢。本文首次克隆了APCaM和PmCaM基因序列，并借助于功能基因分析，研究了兩基因序列差異水平及其表達模式，為CaM基因功能研究及鯛科魚類育種提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣本準備

實驗用魚均來自江蘇省海洋水產(chǎn)研究所人工繁育及養(yǎng)殖。其中，雜交F1與真鯛的仔魚樣本為同樣室內(nèi)條件下培育的30日齡仔魚，雜交F1仔魚體長、體質量分別為（1.10±0.01）cm、（0.040±0.001）g，真鯛仔魚體長、體質量分別為（0.98±0.01）cm、（0.039±0.001）g；成魚樣本取自同一口池塘混合養(yǎng)殖、隨機選取的2齡健康個體，雜交F1成魚體長、體質量分別為（25.15±0.06）cm、（472.1±53.8）g，真鯛成魚體長、體質量分別為（23.82±0.15）cm、（376.81±26.8）g。

因仔魚樣本個體太小，仔魚取整體和成魚的腦、肌肉、鰓、肝、腎、性腺等組織約5～15 mg分別放入裝有RNAlater RNA Stabilization Reagent（QIAGEN）的1.5 mL離心管內(nèi)，并用滅菌后的小號剪刀剪成粒徑小于0.2 mm碎粒，置于4℃冰箱（海爾BCD-649WE）過夜，然后轉20℃保存?zhèn)溆?。用RNeasy Mini Kit（QIAGEN）分別提取仔魚和成魚組織樣本的總RNA。通過分光光度計（Eppendorf）和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度和純度。使用 PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser RR047A試劑盒（TaKaRa）進行反轉錄獲得cDNA模板。

1.2 APCaM與PmCaM基因cDNA全長序列克隆

采用已知的魚類CaM基因的序列設計、合成擴增 CaM序列簡并引物 CaMF／CaMR（表1），以cDNA第一鏈為模板進行基因中間片段的擴增。PCR反應體系（50μL）包括：25μL 2×Ex-Taq Buffer（TaKaRa），1μL dNTP Mix（10 mM），15μL無菌水，1μL Taq DNA聚合酶（5 units·μL－1），3 μL簡并引物（10μM）和 5μL cDNA，最后用50 μL礦物油覆蓋。PCR反應條件如下：94℃4 min預變性；然后94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min；35個循環(huán)；72℃額外擴展10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠分離檢測，用已經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物克隆入pMD18－T載體（TaKaRa），轉化入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α（TaKaRa），經(jīng)PCR驗證后取3個陽性克隆進行測序。

根據(jù)克隆獲得的CaM基因中間片段，設計并合成 5′-RACE和3′-RACE基因特異引物 GSPAPCaM5′、GSP-PmCaM5′、GSP-APCaM3′、GSPPmCaM3′（表 1）。用 5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen）及SMARTer RACE cDNA Amplification Kit試劑盒，按試劑盒說明書進行操作，利用設計特異引物與通用引物配合進行PCR，擴增APCaM與PmCaM的5′－端及3′端cDNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測、克隆、驗證及測序列等步驟后，獲得該基因的5′端及3′端序列。應用DNAStar Lasergene 7.1軟件，分別組裝APCaM與PmCaM基因的5′-RACE片段、中間片段和 3′-RACE片段，拼接生成APCaM與PmCaM基因的cDNA全長序列。

表1 CaM基因cDNA片段擴增與熒光定量PCR的引物與擴增片段長度Tab.1 Primers used for CaM genes cloning and the length of PCR amplifications

1.3 APCaM與PmCaM基因與蛋白的序列分析

CaM基因cDNA的開放閱讀框（open reading frame，ORF）查找用 ORF Finder（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／）。分子量與理論等電點預測采用ExPASy在線服務器的Compute pI／Mw工具 （http：／／www.expasy.org／tools／pi＿tool.html）。結構域分析及Ca2＋結合位點使用NCBI Conserved domains（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure）。信號肽預測分析采用 SignalP（www.cbs.dtu.dk／services／SignalP）［27－28］。CaM的亞細胞定位采用 PSORTⅡ軟件（http：／／psort.ims.u-tokyo.ac.jp／form2.html）。CaM的跨膜區(qū)預測使用 TMHMM Server v.2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）。潛在的糖基化位點使用 Asn-X-Ser／Thr工具進行預測（http：／／cbs.dtu.dk／services／NetNGlyc／）。磷酸化位點分析使用 NetPhos 3.1 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／）。二級結構預測使用DNAman軟件。三級結構預測使用 SWISSMODEL 服 務 器 （http：／／www.expasy.org／swissmod／SWISS-MODEL.html）［29］。APCaM與PmCaM基因全長cDNA序列比對使用clustalX軟件；序列的同源性分析及CaM基因的氨基酸序列相似性搜索，采用在NCBI網(wǎng)站運行BLAST程序［30］。

1.4 APCaM與PmCaM基因的mRNA表達差異分析

根據(jù)已得到的APCaM與PmCaM基因全長cDNA序列，分別設計兩對特異性引物APCaM F／APCaM R和PmCaM F／PmCaM R（表2），用于實時熒光定量PCR。內(nèi)參基因引物為actin F／actin R（表2）。通過 IO-RAD CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，測定CaM基因在AP與Pm不同組織樣本中的表達情況。熒光定量PCR反應體系為20μL，以各樣本的cDNA為模板，反應程序為：95℃預變性3 min；95℃變性10 s，58℃變性20 s，72℃變性20 s，75℃ 變性5 s并采集熒光信號；40個循環(huán)；添加溶解曲線生成程序：95℃到65℃每降0.5℃（5 s）采集一次熒光。樣品和內(nèi)參均設3個重復。實驗結束后，用溶解曲線分析產(chǎn)物專一性，結果用2-ΔΔCT法進行初步數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。用SPSS19.0分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計并分析數(shù)據(jù)的差異性。

表2 熒光定量PCR引物Tab.2 Primers used for fluorescence real-time quantitative PCR

2 結果與分析

2.1 APCaM與PmCaM基因cDNA全長序列的克隆與分析

以設計的簡并引物擴增獲得365bp的CaM基因中間片段，再以此片段設計基因的5′及3′引物，進行PCR擴增及測序等步驟，獲得APCaM和PmCaM的5′及3′序列，軟件拼接獲得APCaM與PmCaM的cDNA片段長度分別為1 230 bp和1 210 bp；cDNA全長序列經(jīng)BLAST比對驗證均屬CaM基因。其中，APCaM基因的全長cDNA序列具有一個450 bp（從序列的96 bp至545 bp處）的開放閱讀框（ORF），編碼一個具149個氨基酸的多肽；具有一個 95 bp的 5′－非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR），3′-UTR長度為 685 bp，包含有 AATAA加尾信號及 poly（A）尾巴；APCaM基因序列中A＋T和C＋G的百分比分別為56.75%和43.25%。PmCaM基因的全長cDNA序列ORF長度同為450 bp（從序列的97 bp至546 bp處），編碼的多肽同為149個氨基酸；5′-UTR長度比 APCaM多 1bp，3′-UTR長度比APCaM少21 bp，同樣包含有AATAA加尾信號及poly（A）尾巴（圖1）；基因序列中 A＋T和 C＋G的百分比分別為56.20%和43.80%。

圖1 真鯛PmCaM基因的cDNA全長序列和推導的氨基酸序列結構Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of PmCaM gene from Pagrus major注：推導的氨基酸序列顯示在對應的核苷酸序列下方；起始密碼子與終止密碼子用紅色標注，5′RACE引物用綠色標注，3′RACE引物用藍色標注，N－糖基化位點用加粗下劃線標注，蛋白激酶C磷酸化位點加粗標注，十四烷基位點用陰影標注，酪蛋白激酶II磷酸化位點用方框標注Notes：Translated aminoacid sequenceisshown under nucleotide sequence and in bold character；initial codon and terminal codon are marked in red，5′RACE primers in green thin under line，3′RACE primers in blue and thick underline，N-glycosylation site marked with bold underline，protein kinase C phosphorylation site bolded，myristyl with shadow marking and double underline，Casein kinase II phosphorylation site marked with box

對基因的氨基酸motif搜索表明APCaM與PmCaM都含有4個 EF-hand結構域（EF-hand calcium-binding）；多肽鏈都含有1個N端糖基化（Asn糖基化）位點，5個酪蛋白激酶Ⅱ（casein kinaseⅡ，CK2）磷酸化位點，2個十四烷基位點，2個蛋白激酶C磷酸化位點（圖1）。

APCaM與PmCaM的ORF序列有7個堿基差異，分別為 C／T，C／G，C／A，A／T，G／A；兩基因蛋白多肽有5個氨基酸差異（圖2），分布在第70、105、117、124及 131位點。序列同源相似性搜索比對得出，APCaM與PmCaM基因在核苷酸水平與其它魚類CaM基因相似性最高達95%（表 3）；APCaM基因與墨西哥脂鯉（Astyanax mexicanus，XP＿022517811.1）、大西洋鯡（Clupea harengus，XP＿012679224.1）及底鳉（Fundulus heteroclitus，XP＿012724361.2）等魚類僅有一個氨基酸差異，相似性達99%，PmCaM基因與這些魚類有4～5個的氨基酸位點差異，相似性為97%。基因比對結果說明APCaM和PmCaM都屬于CaM基因家族，也反映了CaM基因序列的高度保守。另外，雜交F1的APCaM和黑鯛父本（As）該基因AsCaM已知序列比較，長度同樣是149個氨基酸的蛋白多肽，兩序列在第124位點有一個氨基酸不同（K-E），見圖2，此差異程度明顯小于雜交F1與真鯛母本的。

2.2 APCaM與PmCaM蛋白質基本屬性與功能結構分析

對兩種鈣調蛋白理化性質分析得出，APCaM蛋白分子量約為16.84 kDa、理論等電點 pI為4.15，脂肪系數(shù)為65.50，分子式為C720H1134N190O254S10；PmCaM蛋白分子量約為16.80 kDa、理論等電點pI為4.10，脂肪系數(shù)為61.54，分子式為 C719H1129N189O256S10。在組成APCaM與PmCaM兩種蛋白的18種氨基酸中，谷氨酸（Glu）所占的比例最高，達到13.4%，組氨酸（His）所占的比例最低，為0.7%。APCaM與PmCaM蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)略有差異，分別為29.83與 28.21，根據(jù) GRP（Guruprasad-Reedy-Pandit）方法得出兩者均屬蛋白穩(wěn)定。親水性檢測得出GRAVY分別為－0.656（APCaM）與－0.653（PmCaM），均具親水性。信號肽預測結果說明兩蛋白屬非分泌型蛋白。PSORTⅡserver分析得出蛋白的亞細胞定位于細胞之中的可能性最大為52.2%；子程序NNCN預測分析表明兩CaM蛋白94.1%可能性定位于細胞質中。

圖2 APCaM與PmCaM、AsCaM蛋白氨基酸序列差異比較Fig.2 Alignment of APCaM with PmCaM and AsCaM amino acids sequences注：陰影表示相同氨基酸Notes：Consistency sequences are presented by shadow

表3 雜交F1和親本的CaM與其它魚類CaM基因序列的同源性比較Tab.3 Blastn homology search results of CaM gene sequence with other fishes

圖3 雜交子代APCaM與真鯛PmCaM預測的蛋白二級結構（a）、功能域（b）及三維結構（c）Fig.3 Predicted results of the secondary structure（a），domains（b）and the predicted three-dimensional structure（c）of CaM protein search from Pagrus major（Pm）and the hybrids F1（AP）of Acanthopagrus schlegelii（♂）×Pagrus major（♀）注：（b）-Pm中箭頭所示為兩基因氨基酸差異位點Notes：Arrowhead of the（b）-Pm indicates different amino acids loci of two genes

對APCaM和PmCaM蛋白的二級結構預測結果如圖3－a所示，其中，helix表示α螺旋（黑線），strands表示延伸鏈（藍線），coil表示無規(guī)則卷曲（紅線）；蛋白的二級結構組分以α螺旋為主，占61.74% ＞45.00%，無規(guī)則卷曲占32.89%，屬不完全α型蛋白。兩CaM基因的4個EF-hand功能結構域有16個Ca2＋結合位點，見圖3－b。兩基因的蛋白三維結構預測結果空間結構相似、保守，在不規(guī)則卷曲略有不同（圖3－c），CaM均由N端和C端兩個結構域（又稱N-lobe和C-lobe）通過一個中間linker連接組成，包括7個α螺旋，且α螺旋相對位置都很保守。

2.3 CaM基因的mRNA差異表達分析

定量分析得出CaM基因在仔魚及成魚6種組織中均有表達（圖4），表達水平在不同的品種、生長階段及組織中均存在明顯差異，且有較強的組織特異性；表達量較高的為腦與性腺，肝及腎中的表達量較低?；赟PSS19.0軟件分析得出，雜交 F1中，APCaM在腦組織的表達量（19.44）與其它組織相比有極顯著性高表達（P＜0.001）；肌肉、鰓及性腺的組織間表達量無顯著差異（P＞0.05），但其與肝、腎的低表達比較呈極顯著差異（P＜0.01）。真鯛中，PmCaM在性腺的表達水平（7.51）與其它組織相比均有極顯著高表達（P＜0.001），腦與鰓組織間的表達量無顯著差異（P＞0.05），但其與肝、腎和肌肉中的表達量有極顯著差異（P＜0.01），肝、腎和肌肉中的表達量較低且不存在顯著差異。雜交F1APCaM與真鯛PmCaM相比，兩種仔魚CaM的表達水平無顯著差異（P＞0.05）；在6個檢測組織中，腦、性腺及肌肉3種組織中CaM表達量存在極顯著差異（P＜0.001），其中，APCaM在腦及肌肉中的表達量極顯著高于PmCaM，而在性腺中的表達量極顯著的低于PmCaM的水平，鰓中CaM的表達水平顯著差異（P＜0.05），成魚的肝、腎中的基因表達沒有顯著差異（P＞0.05）。黑鯛親本中，已知AsCaM在性腺中表達水平（7.49）顯著高于腦（5.26）和仔魚（4.92）（P＜0.05），極顯著高于肝、腎、鰓及肌肉組織（P＜0.01），肝、腎、鰓與肌肉組織間不存在明顯差異表達［32］。雜交F1和黑鯛父本相比，兩者仔魚CaM的表達水平有極顯著差異（P＜0.01），APCaM在仔魚中的表達量相對較低；在檢測的6種組織中，鰓中CaM的表達水平顯著差異（P＜0.05），APCaM的表達水平高于AsCaM的，其它組織中雜交 F1與黑鯛父本的CaM表達情況，與在真鯛中的差異水平基本一致（圖3）。

圖4 CaM在雜交子代與親本中的定量表達差異比較Fig.4 Relative expression results in various tissues of CaM in the hybrid and parents注：數(shù)值用平均值±標準差；垂線段表示標準差Notes：Values are expressed as mean±sd.Uprightness line mark standard deviation

3 討論

隨著對鈣調蛋白功能重要性的認識加深，CaM成為真核細胞內(nèi)所有Ca2＋結合蛋白中研究得最為透徹的一類［32－35］。越來越多的CaM基因在動物、植物、真菌和原生動物中被分離和克隆出來［36］。不同物種的CaM序列結構在進化上呈很強的保守性［37－38］，研究表明動植物間的 CaM基因氨基酸序列的相似度在90%以上［12］，脊椎動物中有些種類的CaM氨基酸水平完全一致［39］。本研究得到的雜交子代APCaM或真鯛PmCaM氨基酸序列與許多其它魚類的相似性分別達99%或97%，兩基因的ORF區(qū)域編碼149個氨基酸的序列長度及包含有4個EF-hand的結構域，與牙鲆（Paralichthys olivaceus）PoCaM、點帶石斑魚 （Epinephelus coioides）EcCaM、花刺參（Stichopus monotuberculatus）StmCaM及扶桑綿粉蚧（Phenacoccus solenopsis Tinsley）PsCaM 等的ORF區(qū)域一致［39－43］。

本研究得到的APCaM與PmCaM基因之間相差5個氨基酸位點，其差異程度不小于種間水平，例如，花刺參 CaM與中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）CaM相比只有 3個氨基酸位點發(fā)生變換，與合浦珠母貝（Pinctada martensii）相比也僅為4個氨基酸位點發(fā)生變換［40］。有研究表明CaM基因不同亞型的差異部位可能只存在于非編碼區(qū)［44］，包括魚與哺乳動物間的CaM差異位點也主要在3′-UTR［45］?；虻?′-或3′-UTR可以獨自或者協(xié)同作用調節(jié)基因表達［46］，也可以啟動基因的組織特異性表達［47］。實際上，這些非編碼DNA才是遺傳的中心，正是由它們決定基因何時何地何量表達，以及如何高效生產(chǎn)出各種蛋白質［48－49］。APCaM與 PmCaM基因間的3′-UTR還存在21 bp的插入缺失差異，在真鯛母本與雜交子代F1間，是否有導致功能性狀變化的效果，還有待于更多詳細研究。

定量分析表明，CaM基因在仔魚及成魚所檢測的組織中均有表達，在雜交子代與親本間的表達存在明顯不同之處，其中，雜交F1APCaM在腦及肌肉中有極顯著的高表達，在性腺中是極顯著的低表達，而在仔魚期及成魚的鰓中表達水平處于父、母本的中間。真鯛及黑鯛親本中，均是性腺的CaM表達量最大，其次是腦。雜交F1中，APCaM在腦中的表達量最高，其次是肌肉組織，在性腺中的表達處于中間水平。相關研究表明CaM在脊椎動物腦中的含量最豐富［50］；CaM表達對神經(jīng)元的生長和發(fā)育起著重要作用［51］。CaM依賴的蛋白質激酶就是神經(jīng)系統(tǒng)信號轉導的重要激酶［41］。大腦是動物機體的重要生命中樞，說明CaM在維持大腦正常功能中具有重要作用。CaM基因在腦中的超高表達，有助于促進下丘腦－垂體－生長軸相關基因表達來提高生長性能。關聯(lián)到雜交F1的雜種生長優(yōu)勢，推測APCaM與PmCaM、AsCaM相比在腦、肌肉中的極顯著性高表達可能與生長優(yōu)勢有關。基因的高表達量為雜種優(yōu)勢的體現(xiàn)［26］。借助NRK細胞模型研究得出，高表達鈣調素加速細胞的生長［52］。相反，就低表達情況而言，APCaM相比于PmCaM及AsCaM在性腺中表達呈極顯著差異，樣本解剖及性腺切片結果表明，其生殖細胞發(fā)育明顯滯后于親本，且雜交 F1的2齡魚性腺指數(shù)（gonadosomatic index）僅約為同期真鯛或黑鯛的1／3；這一結果也證明CaM可能參與性腺發(fā)育的調控過程［11，27］。對四川白鵝CaM表達量研究也表明該基因在大腦組織中也顯著高于其它組織，并且CaM可能通過影響卵泡細胞增殖和類固醇激素合成來參與調控動物繁殖［53］。類似于APCaM在雜交F1的腦及性腺中的這種表達量超高或低于雙親表達量范圍的情況，有研究關注并認為這種新的基因表達模式是導致雜種優(yōu)勢的原因［26］。雜交F1的這種性狀態(tài)勢一定程度上體現(xiàn)了魚類屬間雜交導致的可育性的不確定，也是基因調控的結果；再者可能是由于生長與生殖在一定程度上有互為負調控的關系。魚類的鰓為與細胞免疫相關的器官［37］，在鰓組織中 APCaM顯著性低于PmCaM的表達，可能也與雜交F1的免疫水平相對低于真鯛的情況相關，這也是該育種研究需進一步探索的內(nèi)容。

另外，不同魚類CaM的表達情況多種多樣，有與本研究得到的基因表達結果相似的，也有明顯不同的，如青島文昌魚（Branchiostoma belcheri tsingtaunese）在鰓及性腺中均是高表達［41］，本研究的結果與之相近；七鰓鰻（Lampetra japonica）主要在腸、鰓、髓及腎中表達，而心、肝組織中幾乎不表達［37］，本文中真鯛及雜交F1的肝中均有表達，但表達量較低，而點帶石斑魚的肝為高表達［43］；赤點石斑魚的腦、心、肝、脾及腎中均有表達，且在精巢中表達最高，肌肉中表達最弱［15］，而雜交F1的肌肉有較高表達量。從這些研究表明，CaM的表達水平只隨魚類品種不同、生長階段不同而有不一樣的結果，總體來說，在魚體主要器官組織中多有較高表達，尤其在腦及性腺中的表達水平更顯著。這些結果加深了對CaM基因調控魚類的生長及性腺發(fā)育等作用的進一步認識。