42%氟茚唑菌胺·嘧菌酯懸浮劑高效液相色譜方法研究

狄鳳娟，江忠萍，王勝翔，姜宜飛*

(1.山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250000；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

1 前言

嘧菌酯化學(xué)名稱(chēng)為(E)-2-{2-[6-(2-氰基苯氧基)嘧啶-4-基氧]苯基}-3-甲氧基丙烯酸甲酯，是一種新型甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑。此類(lèi)化合物的作用機(jī)制是抑制菌體細(xì)胞內(nèi)線粒體的呼吸作用，破壞細(xì)胞中能量的合成，從而對(duì)致病菌體孢子的萌發(fā)、菌絲的生長(zhǎng)和孢子的形成等生長(zhǎng)過(guò)程產(chǎn)生抑制作用[1]。氟茚唑菌胺屬于琥珀酸脫氫酶抑制劑(SDHI)類(lèi)殺菌劑，殺菌譜廣泛。此類(lèi)化合物具有內(nèi)吸性，通過(guò)抑制病原菌線粒體呼吸作用中的琥珀酸脫氫酶而發(fā)揮作用[2]。由于SDHI類(lèi)殺菌劑作用位點(diǎn)單一，易產(chǎn)生抗性，與同為線粒體呼吸作用抑制劑的甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑復(fù)配，因兩者作用位點(diǎn)不同，不易產(chǎn)生交互抗性而很好的解決這一問(wèn)題[3]。

目前氟茚唑菌胺·嘧菌酯懸浮劑的分析方法未見(jiàn)報(bào)道。本文采用反相高效液相色譜法，在同一色譜條件下對(duì)42%氟茚唑菌胺·嘧菌酯懸浮劑進(jìn)行分析，該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，分離效果好，準(zhǔn)確度和精密度均能達(dá)到定量分析的要求。

2 試驗(yàn)部分

2.1 試劑和溶液 乙腈：色譜純；超純水：電阻率18.2MΩ·cm(25℃)；磷酸：分析純；磷酸水溶液：ψ(H2O∶H3PO4)=1 000∶1；氟茚唑菌胺標(biāo)樣：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%；嘧菌酯標(biāo)樣：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%；均由農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所提供；42%氟茚唑菌胺·嘧菌酯懸浮劑(由某公司提供)。

2.2 儀器 高效液相色譜儀：Agilent 1100，具有二極管陣列檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器；Agilent色譜工作站；Millipore超純水制備系統(tǒng)；色譜柱：250mm×4.6mm(id)不銹鋼柱，內(nèi)裝ZORBAX SB-C18、5μm填充物； 過(guò)濾器：濾膜孔徑約0.45μm。

2.3 液相色譜操作條件 流動(dòng)相：ψ(乙腈∶磷酸溶液)=60∶40；流量：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；進(jìn)樣體積：5μL；保留時(shí)間：氟茚唑菌胺約6.9min，嘧菌酯約9.6min。

42%氟茚唑菌胺·嘧菌酯懸浮劑的高效液相色譜圖(圖1)。

圖1 42%氟茚唑菌胺·嘧菌酯懸浮劑高效液相色譜圖

2.4 測(cè)定步驟

2.4.1 標(biāo)樣溶液的配制 稱(chēng)取氟茚唑菌胺和嘧菌酯標(biāo)樣各0.015g(精確至0.000 02g)，置于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.4.2 試樣溶液的配制 稱(chēng)取含氟茚唑菌胺0.015g的試樣(精確至0.000 02g)，置于100mL容量瓶中，先加入5mL水使試樣分散，再用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾。

2.4.3 測(cè)定 在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針標(biāo)樣溶液的響應(yīng)值相對(duì)變化<1.5%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

2.4.4 計(jì)算 將測(cè)得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中氟茚唑菌胺(嘧菌酯)峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中氟茚唑菌胺(嘧菌酯)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω(%)，按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

A1──標(biāo)樣溶液中氟茚唑菌胺(嘧菌酯)峰面積的平均值；

A2──試樣溶液中氟茚唑菌胺(嘧菌酯)峰面積的平均值；

m1──標(biāo)樣的質(zhì)量，g；

m2──試樣的質(zhì)量，g；

P——標(biāo)樣中氟茚唑菌胺(嘧菌酯)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇 通過(guò)Agilent 1100高效液相色譜儀的光譜數(shù)據(jù)采集功能，獲得氟茚唑菌胺、嘧菌酯的紫外波長(zhǎng)掃描圖(圖2)。從圖中可以看到氟茚唑菌胺最大吸收波長(zhǎng)在205nm附近，嘧菌酯最大吸收波長(zhǎng)在195nm附近，為了能兼顧這兩種化合物的檢測(cè)，同時(shí)減少溶劑的干擾，因此將檢測(cè)波長(zhǎng)定為254nm。

圖2 氟茚唑菌胺和嘧菌酯紫外吸收譜圖

色譜柱選擇常用的ZORBAX SB-C18反相柱。依據(jù)氟茚唑菌胺、嘧菌酯物化性質(zhì)，用乙腈作為溶劑溶解樣品，并選擇乙腈和水作為流動(dòng)相，為了得到更好的分離效果和峰形，在1 000mL水里加入1mL磷酸。將流動(dòng)相按不同比例在色譜柱上進(jìn)行試驗(yàn)，最終確定流動(dòng)相為ψ(乙腈∶磷酸溶液)=60∶40，在流速1.0mL/min時(shí)，有效成分與雜質(zhì)能得到很好的分離，峰形對(duì)稱(chēng)，基線平穩(wěn)，并且分析時(shí)間較短，提高了工作效率。

3.2 分析方法的線性相關(guān)性試驗(yàn) 按2.4.1分別配制5個(gè)不同質(zhì)量濃度的氟茚唑菌胺(嘧菌酯)標(biāo)樣溶液，使氟茚唑菌胺的質(zhì)量濃度分別為0.556 0、0.278 0、0.139 0、0.069 50、0.034 75mg/mL，嘧菌酯的質(zhì)量濃度分別為0.655 5、0.327 8、0.163 9、0.081 95、0.040 98mg/mL。在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析，以氟茚唑菌胺(嘧菌酯)質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(mAU)為縱坐標(biāo)，繪制校正曲線。得到氟茚唑菌胺線性方程為y=7 202.3x+13.392，其線性相關(guān)系數(shù)為1.000 0；嘧菌酯的線性方程為y=10 752x+31.349，線性相關(guān)系數(shù)為1.000 0。

3.3 分析方法的精密度試驗(yàn) 從同一產(chǎn)品中準(zhǔn)確稱(chēng)取5個(gè)試樣，在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析。測(cè)得氟茚唑菌胺的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.09，變異系數(shù)為0.43%；嘧菌酯的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.09和變異系數(shù)為0.42%。

表1 分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.4 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 從已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的42%氟茚唑菌胺·嘧菌酯懸浮劑中稱(chēng)取5個(gè)試樣，分別加入一定量的氟茚唑菌胺標(biāo)樣(99.2%)和嘧菌酯標(biāo)樣(99.7%)，在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析，測(cè)得氟茚唑菌胺的平均回收率為100.0%，嘧菌酯的平均回收率為99.97%(表2)。

表2 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

試驗(yàn)建立了高效液相色譜法檢測(cè)氟茚唑菌胺·嘧菌酯懸浮劑中有效成分的分析方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法準(zhǔn)確度和精密度較高，具有操作簡(jiǎn)便，快速的特點(diǎn)，是產(chǎn)品質(zhì)量控制和應(yīng)用研究中較為實(shí)用的方法。