高效液相色譜法在測評乳制品安賽蜜中的應(yīng)用

◎ 阮金如

（紅河州食品藥品檢驗所，云南 紅河 661100）

發(fā)酵乳是以生牛（羊）乳或乳粉為原料，經(jīng)殺菌、發(fā)酵后制成的pH降低的產(chǎn)品。乳酸是以生牛（羊）乳或乳粉為原料，經(jīng)殺菌、接種嗜熱鏈球菌和保加利亞桿菌（德氏乳桿菌保加利亞亞種）發(fā)酵制成的產(chǎn)品，按GB 19302-2010《發(fā)酵乳》執(zhí)行[2]。在日常生活中，最常見的發(fā)酵乳是酸奶，其感官要求包括色澤等。為增加發(fā)酵乳的甜度，大部分乳制品企業(yè)會在生產(chǎn)過程中添加過量的安賽蜜，并不按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)添加。

安賽蜜又叫乙酰磺胺酸鉀，是一種食品添加劑，類似于糖精，易溶于水，可增加食品甜味，其沒有營養(yǎng)，口感好[3]，無熱量，具有在人體內(nèi)不代謝、不吸收（是中老年人、肥胖病人、糖尿病患者理想的甜味劑），對熱和酸穩(wěn)定性好等特點，是當(dāng)前世界上第四代合成甜味劑。安賽蜜為人工合成甜味劑，經(jīng)常食用合成甜味劑超標(biāo)的食品會對人體的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成危害，特別是對老人、孕婦、兒童的危害更為嚴(yán)重。如果短時間內(nèi)大量食用，會引起血小板減少導(dǎo)致急性大出血。通過測評乳制品中安賽蜜的含量，能幫助人們在選購酸奶時，知道安賽蜜的含量，減少因食用安賽蜜后帶來的危害。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀 Agilent 1200 HPLC 系統(tǒng)（美國），配置G1322A型四元梯度泵、G1311型二極管陣列檢測器、G1329A型柱溫度箱、G1316A型自動進樣器、Agilent Chemstation色譜工作站（version B.04.02），超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司KQ-300DE型)，離心機（湘儀H1580型)，電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司，AR224CN型），隔膜真空泵（津騰GM-0.33型），濾膜（津騰微孔濾膜（有機系）直徑50 mm，孔徑0.45 μm）。

1.1.2 試劑

甲醇：色譜純，購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司，純度大于99.9%，批號20160606；乙腈：色譜純，購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司，純度大于99.9%，批號20160605；硫酸銨：分析純，購于天津市風(fēng)船化學(xué)試機科技有限公司，純度大于99.0%，批號20160109；10%硫酸溶液：優(yōu)級純，購于廣州汕頭市酉隴化工有限公司，含量95%～98%，批號20161016；乙酸銨：購于天津市科密歐化學(xué)試機有限公司，純度大于98.0%，批號20160110；無水乙醇：購于天津市風(fēng)船化學(xué)試機有限公司，純度大于99.7%，批號20161015。

1.2 高效液相色譜檢測條件

高效液相色譜儀 Agilent 1200 HPLC 系統(tǒng)（美國安捷倫）；紫外檢測器；自動進樣器；液相色譜柱：Dimonsil C18（2）：cat#99603，5 μm，250 mm×4.6 mm；流動相：甲醇∶乙酸銨=10∶90；流速：1.000 mL/min；波長：214 nm；進樣量：20.00 μL；分析時間：10 min；柱溫：30 ℃。

1.3 實驗步驟

（1）流動相的配制。稱取1.54 g乙酸銨于100 mL的燒杯中攪拌溶解，轉(zhuǎn)移至2000 mL燒杯中，采用蒸餾水少量多次洗滌，洗滌溶液合并轉(zhuǎn)移至2000 mL燒杯中，并加入蒸餾水至1000 mL刻度線，使用玻棒攪拌混和均勻，并超聲5 min，排除CO2，此溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

雨過天晴，剛出世的嬰孩靜靜地睡去了。風(fēng)吹拂著林梢，樹枝上那根濕漉漉的紅腰帶，在凄惶的寒風(fēng)中飄動著。陽光透過云層，照耀著潮濕的林間，濕氣氤氳中，倒也添了此許溫暖。紅琴問風(fēng)影什么時候回寺院，他一聲不吭。許久，他才說，紅琴，我們一起回家吧。她茫然地望著他，一頭霧水。他再次說，回家吧。隨即，他上前扶起她，抱起熟睡的嬰兒，他們相扶著，一步一步地朝林子外邊移去。

（2）樣品前處理。稱取2.00 g酸奶樣品于10 mL具塞比色管中，加無水乙醇5.0 mL并加蒸餾水稀釋至10.0 mL，搖晃混勻并超聲10 min。超聲完畢，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，并于離心機上6000 r/min離心5 min。將離心后的溶液用定量濾紙過濾，得到的濾液并采用接0.45 μm過濾頭的注射器過濾至2 mL進樣瓶中，待測。

（3）儀器檢測。將待測樣品于高效液相色譜檢測條件下排序檢測。

（4）數(shù)據(jù)處理。采用Origin70繪制相關(guān)圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法進行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

國家標(biāo)準(zhǔn)GBT 5009.140-2003中的流動相組成和比例較為復(fù)雜。流動相分別用到硫酸銨、甲醇、乙腈和稀釋為10%的硫酸。其中，硫酸銨800 mL、甲醇150 mL、乙腈50 mL、10%硫酸1 mL，且要求放入同一個瓶子中，超聲混勻。由圖1可以看出，國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測乳制品中安賽蜜的色譜圖分離度不好且出現(xiàn)干擾峰。因此，本文在此基礎(chǔ)上改進流動的種類，尋求低成本、操作簡單的流動相。以云南乍甸乳業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的牛乳之房（樣品1）、乳酸菌飲品（樣品2）和云南多喝乳業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的原風(fēng)味酸奶（樣品3）、草莓調(diào)制乳（樣品4）為研究對象，考察流動相改進前后的高效液相色譜圖，其對照圖如圖2所示。實驗結(jié)果表明，采用含乙酸銨的甲醇作為流動相色譜圖分離度較好，沒有干擾峰的出現(xiàn)。所以，此方法適用于測定乳制品中安賽蜜的含量，同時也適用于測定食品中安賽蜜含量。

圖1 國家標(biāo)準(zhǔn)法檢測乳制品中安賽蜜色譜圖

圖2 新方法檢測乳制品中安賽蜜色譜圖

2.2 流動相比例的選擇

流動相比例是高效液相色譜法進行定性定量分析的關(guān)鍵參數(shù)，因此，實驗對流動相的比例進行考察。以樣品1為研究對象，考察流動相比例對樣品分離的影響。將所得待測液按1.2色譜條件進樣，考察的流動相（甲醇∶乙酸銨）比例分別為10∶90、15∶85、20∶80、25∶75和30∶70。將色譜圖原始數(shù)據(jù)用相似度軟件進行分析，分析后可知在流動相（甲醇∶乙酸銨）比例為10∶90的條件下，色譜圖分離得最好，故選流動相（甲醇∶乙酸銨）比例為10∶90。

2.3 流動相流速的選擇

流動相的流速也是高效液相色譜法進行定性定量分析的關(guān)鍵參數(shù)，因此，實驗對流動相的流速進行考察。以樣品1為研究對象，根據(jù)1.3中的（2）（3）處理樣品，考察了流動相比例對樣品分離的影響。將所得待測液按1.2色譜條件進樣，其中檢測條件流動相、波長、梯度洗脫、柱溫、進樣量不變，改變流速為0.800、1.000、1.200 mL/min。將色譜圖原始數(shù)據(jù)用相似度軟件進行分析，后可知流速0.800、1.000、1.200 mL/min圖譜差異不大，出峰都可以。但由于在0.800、1.200 mL/min條件下的保留時間發(fā)生位移，相似度較差。故選澤流動相流速1.000 mL/min。

2.4 線性回歸方程、線性范圍

對配制的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別于高效液相色譜儀上檢測分析，結(jié)果見表1，其中濃度為0.01 mg/mL的色譜圖見圖3。同時比較了標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的色譜圖，如圖4所示。

表1 工作標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測結(jié)果表

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品中安賽蜜含量的檢測色譜圖

圖4 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中安賽蜜含量檢測對比色譜圖

2.5 分析方法的考察

2.5.1 重復(fù)性實驗

取同一供試樣品平行制備3份供試溶液，考察樣品中各成分含量的RSD，以此結(jié)果驗證是否滿足色譜圖的測定要求。安賽蜜的含量（n=3）分別為0.025、0.024、0.027 g/kg，RSD分別為4.3%、3.8%、5.5%。表明重復(fù)性好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗

取供試樣品溶液，分別在0 h、5 h、15 h進行樣品穩(wěn)定性情況考察。查看各組分的峰面積以及相對保留時間的RSD，以此證明樣品溶液時間的穩(wěn)定性。各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.5%，相對峰面積的RSD小于10%，建立的色譜圖譜精密性比較好。說明樣品在15 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 加樣回收率實驗

制備3份供試品溶液，另制備一個不加對照品溶液的空白對照溶液，以確定回收率，結(jié)果見表2。

表2 乳制品中安賽蜜成分加標(biāo)的回收率

結(jié)果表明，方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率均良好，滿足定量要求。

3 結(jié)論

通過改變國家標(biāo)準(zhǔn)方法中的流動相，建立安賽蜜的色圖譜，采用Origin70軟件對色圖譜進行分析對比。結(jié)果如下：①國家標(biāo)準(zhǔn)方法的流動相分別用到硫酸銨、甲醇、乙腈和稀釋為10%的硫酸4種不同的化學(xué)試劑且配制復(fù)雜，特別是硫酸的稀釋，容易燒傷皮膚，稀釋過程中釋放的煙霧刺激人體呼吸系統(tǒng)，而自創(chuàng)方法中的流動相配制簡單且安全。②國家標(biāo)準(zhǔn)方法得到的色譜圖分離程度不夠明顯，出現(xiàn)干擾峰，影響對安賽蜜出峰的判斷，自創(chuàng)方法得到的色譜圖分離度較好，沒有干擾峰的出現(xiàn)，能對安賽蜜的出峰情況和時間有一個很好的把控。同時，視覺效果比國家標(biāo)準(zhǔn)法好。③自創(chuàng)法得到的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線良好，R2=0.99988。④自創(chuàng)法中方法的精密度，重復(fù)性，穩(wěn)定性均良好，RSD值小于10%，加樣回收率分別為103%、107%、110%，RSD值也小于10%。⑤通過自創(chuàng)法，測得的安賽蜜含量與供試品標(biāo)簽上標(biāo)的基本一致。

綜上所述，該實驗所建立的高效液相色譜法測評乳制品中安賽蜜的分析方法快速、簡單，方法可靠，可運用其他乳制品中安賽蜜含量的測定。