花露水及其混合物對(duì)蛋白核小球藻的毒研究

卞志強(qiáng)，丁婷婷，張 瑾,2，董欣琪

(1.安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽省水污染控制與廢水資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230601；2.清華大學(xué)新興有機(jī)污染物控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084）

0 引言

花露油為花露水的主題香料，以酒精為輔制成香水類產(chǎn)品，作為夏天常用物品，清熱解毒、驅(qū)蚊殺菌止癢、無副作用、不刺激皮膚、滋潤(rùn)皮膚的功效[1]。但是媒體報(bào)道花露水中含有農(nóng)藥成分，可是專家檢測(cè)發(fā)現(xiàn)花露水中只是含有極其少量的農(nóng)藥成分，媒體與專家說法存在差異，經(jīng)過查閱資料分析了花露水中有香精、蛇膽提取液、人工合成牛黃等成分，香精具有很好的穩(wěn)定性和持久性，但大量的使用也會(huì)對(duì)嬰兒的神經(jīng)系統(tǒng)和造血系統(tǒng)造成破壞，香精的安全性依賴于其中所含香料和輔料是否符合安全性要求，所以，調(diào)香工作者在為某加香成品設(shè)計(jì)香精配方時(shí)，就要根據(jù)該加香成品的使用要求來選用包括持久性、穩(wěn)定性和安全性在內(nèi)的合適的香料和輔料，三者不可偏廢。這樣才能控制毒性的擴(kuò)大。所以探索花露水毒性效應(yīng)彰顯重要意義。

Zhu等[2]采用的濃度-時(shí)間-效應(yīng)曲面(C T ES)研究得知毒性隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，不同種類的毒性物質(zhì)，它們的毒性增加幅度存在不同。所以毒性檢測(cè)要重視時(shí)間點(diǎn)對(duì)暴露生物的效應(yīng)和暴露生物隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)效應(yīng)[3]。只有這樣以后的研究才能更加深入的了解污染物毒理的作用機(jī)制、作用途徑和污染物毒理。

所以用3種花露水六神花露水、蛇膽花露水、金銀花花露水作為研究對(duì)象，研究3種花露水及其混合物對(duì)綠藻蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)的時(shí)間毒性。再根據(jù)3種花露水在不同暴露時(shí)間的毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果做為花露水在其它方面毒性分析作為參考依據(jù)，以便解決相關(guān)的毒性問題，為環(huán)境的改善作出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：3種不同品牌的花露水，六神、蛇膽和金銀花，購(gòu)自超市?；端旧砭褪且粋€(gè)含各種成分的混合物[4]。

儀器包括：Synergy 2 Multi-Mode微板光度計(jì)（美國(guó)Bio Tek伯騰儀器有限公司）、超凈工作臺(tái)（三發(fā)儀器有限公司）、FA1004型五位電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）、YX280A手提式壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）、SC-242型透明門立式冷藏柜（青島海爾電冰柜有限公司）、B S-2E 數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱（上海梅香儀器有限公司）、D H G-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）和D r a g o n-l a b單道可調(diào)移液器(10-100μL)(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 藻種培養(yǎng)

蛋白核小球藻(C.p y r e n o i d osa)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)(FA C HB)，其培養(yǎng)基采用SE培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的配制和藻培養(yǎng)過程參見文獻(xiàn)[6]。

1.3 混合物設(shè)計(jì)

將本實(shí)驗(yàn)體積比法設(shè)計(jì)了3種花露水兩兩之間的混合物體系3個(gè)，每個(gè)混合物體系設(shè)計(jì)了1：1、1：2、1：3、2：1和3：1不同體積比的5個(gè)混合物，然后結(jié)合固定射線法，將個(gè)混合物擴(kuò)展成體積比相同的射線，即5條混合物射線，共15個(gè)混合物射線。

1.4 微孔板設(shè)計(jì)與毒性測(cè)試

花露水的易揮發(fā)性會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)造成很大無誤差，因此，研究中的微孔板在過去設(shè)計(jì)方案的基礎(chǔ)上，參考了陳瓊等[3]實(shí)驗(yàn)改進(jìn)方法。

1.5 時(shí)間毒性計(jì)算與數(shù)據(jù)處理

計(jì)算公示參見文獻(xiàn)[2]。數(shù)據(jù)處理采用Weibull(1)和Logit(2)兩種非線性函數(shù)進(jìn)行擬合：

式中α、β－Weibull和Logit的位置與斜率參數(shù)

E－效應(yīng)即污染物對(duì)綠藻Cpyrenoidosa的生長(zhǎng)抑制率[5]

c－濃度(表示為花露水在實(shí)驗(yàn)中實(shí)際被稀釋倍數(shù)的倒數(shù))

2 結(jié)果與分析

2.1 單個(gè)物質(zhì)濃度-效應(yīng)曲線(CRC)

非線性函數(shù)能較好擬合3種花露水對(duì)綠藻在不同時(shí)間的濃度-毒性數(shù)據(jù)，不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的擬合CRC s見圖1。圖1可看出：藻受3種花露水單獨(dú)作用的毒性都清楚表現(xiàn)出時(shí)間依賴性，JYH、LS和SD在0～12 h內(nèi)均無明顯的毒性，JYH在24h內(nèi)仍無明顯毒性，等到24 h之后所受到毒性開始迅速增加，直到45 h達(dá)到最大值，之后毒性開始下降到72 h趨于穩(wěn)定；L S在48 h內(nèi)無明顯毒性，直到48 h后才開始迅速增加，增加到72 h后毒性達(dá)到最大值；SD在12 h后毒性就開始迅速增加，30 h時(shí)達(dá)到最大值，然后開始下降直到72 h毒性增長(zhǎng)速度趨于平緩。

圖2是3種花露水的不同毒性指標(biāo)值隨時(shí)間變化曲線。從圖2可看出：三種物質(zhì)的毒性同樣具有時(shí)間依賴性，但物質(zhì)種類不同導(dǎo)致時(shí)間毒性變化規(guī)律也不相同：J Y H和SD的p EC20和p EC30值是隨時(shí)間延長(zhǎng)先增強(qiáng)后有下降趨勢(shì)，p EC40和p EC50值隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加；L S的p EC20、p EC30和p EC40隨時(shí)間逐漸增加，最大毒性上未超過50%的效應(yīng)p EC50值一直是0；對(duì)于同一暴露時(shí)間，3個(gè)物質(zhì)的同一毒性指標(biāo)隨時(shí)間也是變化的，但在72 h和96 h，L S的p EC20、p EC30和p EC40值明顯大于J Y H和SD的p EC20、p EC30和p EC40值p EC20、p EC30和p EC40值明顯大于J Y H和SD 的p EC20、p EC30和p EC40值。

圖1 3種花露水在6個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的濃度-效應(yīng)曲線(■0h；●12h；▲24h；○48h；◇72h；★96h)

圖2 3種花露水毒性隨濃度的變化曲線(■0h；●12h；▲24h；○48h；◇72h；★96h)

2.2 混合物濃度-效應(yīng)曲線CRC

時(shí)間毒性微板分析法測(cè)得花露水混合物（金銀花、蛇膽）在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)下濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)以及使用非線性最小二乘擬合方法得到的C R C s，見圖3。為了能夠比較不同體積比的兩元花露水混合物在同一時(shí)間節(jié)點(diǎn)的毒性大小，四個(gè)毒性指標(biāo)值p EC20、p EC30、p EC40和p EC50隨時(shí)間的變化見圖4。

從圖3可以看出：金銀花和蛇膽的混合物變化規(guī)律[5]基本與單一花露水的變化規(guī)律相同，可是不同體積比的混合物毒性大小是和兩種組分在混合物中所占比例存在很大的關(guān)系，即為濃度較高的物質(zhì)對(duì)混合物的毒性大小起著主導(dǎo)作用。

圖3中得出：暴露時(shí)間為48 h毒性大小順序?yàn)椋?:1＞1:2＞1:3＞3:1＞1:1；72h：2:1＞1:2＞1:3＞3:1＞1:1；96 h：1:1＞3:1＞2:1＞1:3＞1:2；96 h：1:2＞1:3＞2:1＞3:1＞1:1?？梢缘弥?種不同體積比的混合物毒性均是隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，明確的表現(xiàn)出時(shí)間依賴性。

圖3 6個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的JS混合物的濃度-效應(yīng)曲線(■0h；●12h；▲24h；○48h；◇72h；★96h)

圖4 3種花露水的毒性隨時(shí)間的變化曲線(■0h；●12h；▲24h；○48h；◇72h；★96h)

圖4 可看出混合物的毒性均從24 h以后開始急劇增加，72 h時(shí)開始趨于平緩且不再變化，可能由于隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加花露水中有較多的成分揮發(fā)使得毒性減弱，但可以看出隨時(shí)間混合物毒性都在增加，包括金銀花與六神以及六神與蛇膽的混合物均符合規(guī)律，都表現(xiàn)明顯時(shí)間依賴性。

上述結(jié)果表明：護(hù)膚品花露水的毒性會(huì)隨著物質(zhì)存在的時(shí)間的變化而變化，極大對(duì)人體或環(huán)境造成影響，所以研究生活中花露水的毒性變化規(guī)律，掌握花露水最大無作用量以及最小有作用量指標(biāo)非常重要，對(duì)我們正確使用花露水減少對(duì)人體以及環(huán)境的傷害有著非常重要的意義。

3 結(jié)論

3種花露水以及花露水混合物對(duì)小球藻毒性隨時(shí)間變化而逐漸變化的規(guī)律，實(shí)驗(yàn)測(cè)定隨時(shí)間變化花露水的毒性先急劇增大，再趨于平穩(wěn)，不同暴露時(shí)間點(diǎn)的毒性大小也各不相同，以花露水單一物質(zhì)為例，以半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)的負(fù)對(duì)數(shù)p EC50為毒性指標(biāo)，暴露時(shí)間48 h時(shí)毒性大小順序?yàn)椋毫瘢旧吣懀窘疸y花;暴露時(shí)間為72 h時(shí)：蛇膽＞金銀花＞六神;暴露時(shí)間為96 h時(shí)毒性大小順序?yàn)椋荷吣懀窘疸y花＞六神；花露水各濃度比混合物毒性變化規(guī)律與單一花露水變化規(guī)律基本相同，經(jīng)歷先不變?cè)偌眲≡黾幼詈蟛蛔內(nèi)齻€(gè)過程?；端亩拘詴?huì)隨著時(shí)間的增加而增加，這就可以通過依靠時(shí)間來控制其毒性的污染?；端捌浠旌衔飳?duì)蛋白核小球藻的毒性不僅僅與時(shí)間有關(guān)，還與濃度、受試物的敏感性、氣象條件等有關(guān)。所以這都對(duì)我們研究環(huán)境污染有著巨大的挑戰(zhàn)，同時(shí)也能夠更好的為環(huán)境的治理提供機(jī)會(huì)。