甜菜堿型兩性離子聚合物的水解及其對抗菌性能影響的研究

劉東立 陳昌林 郎美東

1上海東杰高分子材料有限公司 （上海 201108）2華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院 （上海 200237）

兩性離子聚合物獨(dú)特的兩性離子結(jié)構(gòu)使其具有一些獨(dú)特的性質(zhì)[1-3]。一方面，兩性離子聚合物微凝膠具有與蛋白質(zhì)核酸等生物大分子相似的分子結(jié)構(gòu)，因而具有良好的生物相容性；另一方面，其分子鏈上的酸堿基團(tuán)之間可以形成離子鍵，與共價(jià)鍵相比，屬于弱的相互作用，因此，其對環(huán)境的變化更為敏感。

另外，大多數(shù)兩性離子聚合物鏈內(nèi)引入—OH，—COOH，—SO3H及胺基等親水基團(tuán)，從而具有良好的抗非特異性蛋白質(zhì)吸附、抗細(xì)菌黏附及抗凝血等性能[4]。兩性離子聚合物在分離技術(shù)[5]、生物醫(yī)用材料[6]、醫(yī)療器件[7]、藥物基因載體[8-11]，尤其在高效防生物污損領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[12]。

聚[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)銨 (PDMAPS,也稱PSBMA)和聚[3-(甲基乙烯酰胺)丙基]二甲基-(3-磺酸丙基)銨 (PDMMPPS,也稱PSPP)是兩類典型的磺酸基甜菜堿型兩性離子聚合物。其兩性離子基團(tuán)通過酯鍵或酰胺鍵與聚合物主鏈相連，而這些酯鍵或酰胺鍵可水解，水解會使聚合物失去兩性離子基團(tuán)從而失去兩性離子聚合物的功能性；但二者的水解性能有明顯的差異。由于酯鍵的穩(wěn)定性比酰胺鍵的穩(wěn)定性差，所以PDMAPS的穩(wěn)定性比PDMMPPS差：Pascaline Mary[13]報(bào)道了經(jīng)一次透析提純的PDMAPS的水解率高達(dá)13%左右，而帶有酰胺鍵的PDMMPPS只有8%。這說明了無論是PDMAPS還是PDMMPPS，在作為防污抗菌材料應(yīng)用時(shí)，必定會由于水解而失去兩性離子基團(tuán)，從而使防污效果大大下降，而PDMAPS則更為嚴(yán)重，因此，有必要對其水解情況進(jìn)行進(jìn)一步的探究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

1,3-丙磺酸內(nèi)酯，99%，上海晶純生化科技股份有限公司；蛋白胨（FP318）、酵母粉（LP0021），安琪酵母股份有限公司；大腸桿菌，生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；乙醇（分析純）、鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（98%）、磷酸二氫鉀（化學(xué)純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（99.5%，分析純），上海泰坦科技股份有限公司；過硫酸鉀（分析純）、亞硫酸氫鈉（分析純）、丙酮（99.5%），上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；[2-(甲基丙烯?；趸?乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)銨 (DMAPS)、[3-(甲基乙烯酰胺)丙基]二甲基-(3-磺酸丙基)銨（DMMPPS），99.5%，常州一品堂化學(xué)有限公司。

1.2 PDMAPS以及PDMMPPS的制備

稱取單體DMAPS 3 g，溶解于45 mL的0.1 mol/L的NaCl溶液中，加入到100 mL的反應(yīng)瓶中；分別稱取過硫酸鉀8.1 mg和亞硫酸氫鈉4.05 mg，溶解后加入到反應(yīng)瓶中；密封后，反復(fù)抽氣并通入氬氣，以除去反應(yīng)瓶中及溶液中的氧氣；置于30℃的條件下反應(yīng)8 h左右。PDMMPPS的制備方法同上。

1.3 兩性離子聚合物水解實(shí)驗(yàn)

1.3.1 PDMAPS和PDMMPPS在不同pH條件下的水解

稱取PDMAPS及PDMMPPS各1 g，稱量3份，分別溶解于50 mLPBS溶液（磷酸鹽緩沖溶液）、50 mL0.1 mol/L的NaOH溶液 (pH=13)以及50 mL0.1 mol/L的鹽酸溶液(pH=1)中；準(zhǔn)備15支干凈的試管，將試管分別編號 A1～A5，B1～B5，C1～C5，然后將50mL聚合物溶液分成5份，每份10 mL，分別裝入ABC編號的試管中，A表示PBS溶液，B表示NaOH溶液，C表示鹽酸溶液；將這15支試管置于37℃的恒溫振蕩箱中振蕩，每隔10 d依次取出編號1,2,3,4,5的樣品，在蒸餾水中透析1 d，冷凍干燥后送核磁檢測。

1.3.2 PDMAPS的常溫透析水解

稱取聚合成功的PDMAPS 2 g，溶解于100 mL0.1 mol/L的NaCl溶液中，配制成0.02 g/mL的聚合物溶液。將聚合物溶液分成2等份，作為平行樣作對比。在室溫(25℃)條件下，將2份50 mL聚合物溶液分別在0.1 mol/L的NaCl溶液中透析（透析袋能透過分子的相對分子質(zhì)量低于7000），記錄時(shí)間，每隔 1 天換一次蒸餾水，分別在第 1，3，6，12，24，48 和96 d取一次樣，每次取樣5mL左右，取出的樣進(jìn)行冷凍干燥，然后做1H-NMR測試。為防止外界灰塵、空氣等條件的干擾，透析過程盡量在恒溫的密閉條件下進(jìn)行。

1.3.3 PDMAPS和PDMMPPS在高溫條件下的水解

稱取聚合成功的PDMAPS及PDMMPPS各1 g，溶解于50 mL0.1 mol/L的NaCl溶液中，加入到100 mL的燒瓶中，在80℃條件下冷凝回流3 d，然后在蒸餾水中透析1 d，冷凍干燥后送核磁檢測。

1.4 抗菌測試

培養(yǎng)基配制：將1 g酵母粉，2 g蛋白胨，2 g Na－Cl，4 g瓊脂粉放入錐形瓶中，倒入200 mL去離子水配制成溶液。

培養(yǎng)液配制：將1 g酵母粉，2 g NaCl以及2 g蛋白胨放入錐形瓶中，倒入200 mL去離子水配制成溶液。

無菌水為0.85%的NaCl溶液。

滅菌處理：將做抗菌實(shí)驗(yàn)需要的玻璃儀器洗凈，然后將其和槍頭、離心管（EP管），以及配制好的無菌水、培養(yǎng)液和培養(yǎng)基等放在全自動(dòng)高壓滅菌鍋中，在115℃下高壓滅菌20 min，取出后放在紫外無菌操作臺上，以防止染上雜菌。

大腸桿菌的培養(yǎng)：取4 mL原菌液，滴入到培養(yǎng)液中，密封，這一過程需在無菌臺上操作；將培養(yǎng)液放置在恒溫振蕩箱中振蕩5 h，得到陰性大腸桿菌菌液。菌液需要檢驗(yàn)大腸桿菌的濃度，其值不能過高或過低?？梢匀∩倭烤?，稀釋10倍，使用分光光度計(jì)測量，吸光度值在0.1～0.2之間比較適宜。

固體培養(yǎng)基的制備：剛滅菌后的高溫液體培養(yǎng)基倒入滅菌后的培養(yǎng)皿中，然后放在紫外無菌操作臺上讓培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基冷卻凝固，凝固后蓋上培養(yǎng)皿蓋倒置以做備用。每個(gè)樣品需要使用2個(gè)固體培養(yǎng)基做平行樣，本實(shí)驗(yàn)中，有空白對照組，未水解的PDMAPS，12 d常溫透析水解的PDMAPS和96 d常溫透析水解的PDMAPS共4組樣品，所以需要8個(gè)培養(yǎng)皿。

抗菌實(shí)驗(yàn)步驟：稱取未水解的PDMAPS，12 d常溫透析水解的PDMAPS和96天常溫透析水解的PDMAPS各120 mg，分別加入到已經(jīng)滅菌的錐形瓶中，編號1，2，3，空白錐形瓶編號為4；取準(zhǔn)備好的陰性大腸桿菌菌液20 mL加入到4個(gè)錐形瓶中，待產(chǎn)物溶解后，使用棉紗布將瓶口封住，放入ZQLY-180 T振蕩培養(yǎng)箱中在37.0℃下培養(yǎng)5 h；取100μL菌液在EP管中使用無菌生理鹽水逐步稀釋107倍，再取稀釋107倍后的菌液100μL逐滴滴在固體培養(yǎng)基表面的中心位置，使用涂布棒將大腸桿菌菌液均勻地涂布在固體培養(yǎng)基表面，然后按照樣品的順序進(jìn)行編號；將編號后的培養(yǎng)皿倒置放入37.4℃的SPX-300B-G型微電腦光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，然后取出培養(yǎng)皿，拍照并統(tǒng)計(jì)大腸桿菌菌落數(shù)目。為確保操作過程中不染菌，整個(gè)操作在點(diǎn)燃酒精燈的無菌臺上完成，并且需要保證操作過程的規(guī)范性。

1.5 測試與分析

采用德國Brucker AVANCE 500超導(dǎo)傅里葉變換核磁共振波譜儀對共聚物進(jìn)行1H-NMR表征；采用美國Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜儀，使用KBr壓片法對樣品官能團(tuán)進(jìn)行紅外表征；采用北京普立泰科儀器有限公司的PL-GPC 50型DMF相凝膠滲透色譜儀進(jìn)行GPC表征；采用杭州格圖科技有限公司的BM-18雙目生物顯微鏡對大腸桿菌在薄膜表面的黏附情況進(jìn)行觀察；采用活菌平板計(jì)數(shù)法研究薄膜對大腸桿菌的致死率；采用日本理學(xué)株式會社的Ultima IV X射線衍射儀進(jìn)行X射線光電子能譜分析（XPS）。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩性離子聚合物的制備

PDMAPS和PDMMPPS均為白色塊狀固體，硬而脆，產(chǎn)率為85%，相對分子質(zhì)量大約為5萬。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖 1 DMAPS（a）和 DMMPPS（b）的結(jié)構(gòu)式

2.2 兩性離子聚合物的水解

PDMAPS和PDMMPPS均為水溶性兩性離子聚合物，二者核磁共振氫譜分別如圖2和圖3所示。圖2 中化學(xué)位移：a(2H,1.7～1.9)，b(3H,0.7～1.1)，c(2H,4.2～4.5)，d(2H,3.6～3.8)，e(6H,3.0～3.2)，f(2H,3.4～3.6)，g(2H,2.1～2.3)，h(2H,2.8～3.0)?？梢酝ㄟ^ b 峰與 e 峰的強(qiáng)弱來判斷聚合物的水解程度。PDMAPS水解前b峰強(qiáng)度與e峰強(qiáng)度之比（b/e）為3∶6，酯鍵水解斷裂并經(jīng)透析后，e峰削弱，b/e值增大，初始的PDMAPS和水解后b/e值的這種差異可以用來粗略分析其水解率。同理，PDMMPPS也通過這種方法測定水解度。可以令b0=b1=3，則水解率：

式中：b0，e0為未水解 PDMAPS 的 b，e 峰強(qiáng)度；b1，e1為水解后PDMAPS的b,e峰強(qiáng)度。

圖2 PDMAPS的1H-NMR譜圖

圖 3 PDMMPPS 的 1H-NMR 譜圖

通過XPS測定聚合物的元素組成，可以較為精確地分析出聚合物的水解程度。理論上，聚合物中各元素的物質(zhì)的量比為 n（C）∶n（N）∶n（O)∶n(S)=11∶1∶5∶1，水解之后由于酯鍵的斷裂會導(dǎo)致N，S元素比例的減少，通過分析C元素與N元素或S元素的比值[x（C）/x（N）或 x（C）/x（S）]來確定水解率。因?yàn)榇嬖谝欢ǖ南到y(tǒng)誤差使得初始x（C）/x（N）值不能準(zhǔn)確地保證在11，所以計(jì)算過程中以初始的XPS中顯示的比值為準(zhǔn)。計(jì)算公式見式（2）。

其中：φ表示水解率；x(C)0，x(C)1表示水解前后C元素的物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)，x(N)0，x(N)1表示水解前后N元素的物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)。

2.2.1 PDMAPS在不同pH條件下的水解結(jié)果

在不同pH條件下的水解實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)有3組不同pH的水解溶液，分別為鹽酸溶液(pH=1)，PBS溶液(pH=7.4)，NaOH溶液(pH=13)。每組有5組不同時(shí)間段的樣品，分別為 10，20，30，40 和 50 d。本實(shí)驗(yàn)取了第20 d和第40 d的結(jié)果做了核磁共振譜圖，結(jié)果如下。

（1） 酸性條件下的水解

圖4反映酸性條件下PDMAPS在第20，40 d時(shí)的水解情況。初始PDMAPS核磁共振譜圖（見圖2） 中，e0/b0=2.15，20 d 后 e1/b1=2，40 d 后 e2/b2=1.98。代入公式（1），可得水解率φ1=7.0%，φ2=7.9%。酸性條件下水解結(jié)果表明：酯在酸性條件下穩(wěn)定性較好，存在微弱水解且水解緩慢，40 d后水解率達(dá)7.9%。

圖4 PDMAPS在酸性條件下第20，40 d時(shí)的水解情況

（2） 中性條件下的水解

圖5反映了中性條件下PDMAPS在第20，40 d時(shí)的水解情況。在初始PDMAPS核磁共振譜圖中，e0/b0=2.00，20 d 后 e1/b1=1.99，40 d后 e2/b2=1.94。代入公式（1），可得水解率φ1=0.5%，φ2=3%。中性條件下的水解結(jié)果表明：酯在中性條件下穩(wěn)定性較好，幾乎不怎么水解，水解緩慢，40 d后水解率僅僅達(dá)到3%。

（3） 堿性條件下的水解

圖6反映了堿性條件下PDMAPS在第20，40 d時(shí)的水解情況。在初始PDMAPS核磁共振譜圖中，e0/b0=2.35，20 d 后 e1/b1=1.66，40 d 后 e2/b2=1.04。代入公式（1），可得水解率 φ1=29.4%，φ2=55.7%。堿性條件下的水解結(jié)果表明：酯鍵容易在堿性條件下水解，20 d后達(dá)到29.4%，40 d后達(dá)到55.7%。

為清楚地表示PDMAPS在不同pH下的水解情況，將核磁結(jié)果處理成水解率數(shù)據(jù)，具體見表1。

圖5 PDMAPS在中性條件下第20,40 d時(shí)的水解情況

圖6 PDMAPS在堿性條件下第20,40 d時(shí)的水解情況

表1 PDMAPS在不同pH條件下的水解率%

2.2.2 PDMMPPS在不同pH條件下的水解結(jié)果

（1） 酸性條件下的水解

圖7反映了酸性條件下PDMMPPS在第20，40 d時(shí)的水解情況。初始PDMMPPS核磁共振譜圖（見圖 3） 中，f0/b0=2.22，20 d 后 f1/b1=1.99，40 d 后 f2/b2=1.81。代入公式（1），可得水解率φ1=10.3%%，φ2=18.5%。酸性水解結(jié)果表明酰胺鍵在酸性條件下比較容易水解，40 d后水解率能夠達(dá)到18.5%。

圖7 PDMMPPS在酸性條件下第20天、40天的水解

（2） 中性條件下的水解

圖8反映了中性條件下PDMMPPS在第20，40 d時(shí)的水解情況。初始PDMMPPS核磁共振譜圖中，f0/b0=2.07，20 d后 f1/b1=2.06，40 d后 f2/b2=2.04。代入公式（1），可得水解率φ1=0.5%，φ2=1.4%。中性水解結(jié)果表明：酰胺鍵在中性條件下幾乎不水解，40 d后水解率僅約為1.4%。

（3） 堿性條件下的水解

圖9反映了堿性條件下PDMMPPS在第20，40 d時(shí)的水解情況。初始PDMMPPS核磁共振譜圖中，f0/b0=2.14，20 d后 f1/b1=2.14，40 d后 f2/b2=2.14。代入公式（1），可得水解率 φ1=0，φ2=0。堿性水解結(jié)果表明酰胺鍵在堿性條件下不水解，40 d后聚合物核磁沒有變化。

為清楚地表示PDMMPPS在不同pH條件下的水解情況，將核磁結(jié)果處理成水解率數(shù)據(jù)，見表2。

2.2.3 PDMAPS的常溫透析水解

2.2.3.1 PDMAPS的常溫透析水解核磁分析

為了進(jìn)一步研究PDMAPS的水解情況和機(jī)理，在常溫條件下不斷地?fù)Q水，除去水解產(chǎn)生的小分子基團(tuán)，觀察進(jìn)一步的核磁結(jié)果。從透析水解前后的核磁對比圖可以看出，e/b的值逐漸減小，意味著聚合物存在緩慢水解。表3列出了e/b值以及水解率，初始e/b值為2.23。

圖8 PDMMPPS在中性條件下第20,40 d時(shí)的水解情況

圖9 PDMMPPS在堿性條件下第20,40 d時(shí)的水解情況

表2 PDMMPPS在不同pH條件下的水解率數(shù)據(jù)%

從表3可以看出隨著小分子基團(tuán)的除去，水解緩慢進(jìn)行，說明PDMAPS中的酯鍵也存在一定的水解平衡，當(dāng)除去水解產(chǎn)物時(shí)，平衡被打破，水解反應(yīng)正向進(jìn)行，雖然水解較為緩慢，但100 d左右能夠高達(dá)21.5%。

表3 PDMAPS在常溫條件下透析水解數(shù)據(jù)

2.2.3.2 PDMAPS常溫透析水解XPS測試

為了進(jìn)一步驗(yàn)證水解結(jié)果的可靠性，將透析水解96 d后的樣品與未做水解的樣品進(jìn)行XPS測試，結(jié)果如圖10所示。

圖10 PDMAPS透析水解前后XPS對比圖

從圖10可以看出，C，N，O，S 4種元素的峰均有一定的削弱。這說明聚合物發(fā)生了變化，使得支鏈元素減少，由此推斷聚合物發(fā)生了水解。4種元素的組成見表4。

表4 PDMAPS透析水解前后的元素組成%

根據(jù)公式（2）：按照 x(C)/x(N)值計(jì)算得出 t=0.916，水解率φ=21.8%；根據(jù)x(C)/x(S)值計(jì)算得出t=0.913，水解率φ=20.8%。上述結(jié)果均很接近核磁分析的結(jié)果（φ=21.5%），說明了數(shù)據(jù)的可靠性。

2.2.4 PDMAPS和PDMMPPS在高溫條件下的水解

為了進(jìn)一步研究PDMAPS酯鍵和PDMMPPS酰胺鍵的穩(wěn)定性，分別將制備好的PDMAPS和PDMMPPS置于80℃、0.1 mol/L的NaCl溶液中冷凝回流3 d，然后除雜透析，冷凍干燥后送核磁分析。圖11和圖12分別表示了PDMAPS和

PDMMPPS水解前后的核磁對照，結(jié)果表明：酰胺鍵的熱穩(wěn)定性強(qiáng)于酯鍵；根據(jù)e0/b0=2.03，e1/b1=1.45，推算出PDMAPS的酯鍵水解率φ=28.6%；根據(jù)f0/b0=2.11，f1/b1=2.03，推算出PDMMPPS的酰胺鍵水解率φ=3.8%。

圖11 PDMAPS在80℃下水解前后的核磁對照

圖12 PDMMPPS在80℃下水解前后的核磁對照

2.3 PDMAPS在常溫條件下透析水解前后的抗菌性能對比

核磁和XPS結(jié)果均顯示PDMAPS在常溫條件下透析存在緩慢水解，為了驗(yàn)證緩慢的部分水解對其抗菌性能的影響，分別取0，12，96 d時(shí)的水解樣品做抗菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖13和圖14所示。

結(jié)果表明常溫透析時(shí)間越長，抗菌效果越差。隨著時(shí)間的延長，水解緩慢進(jìn)行，而抗菌效果變差，說明聚合物中起抗菌效果的基團(tuán)主要為季銨磺酸鹽，即兩性離子基團(tuán)，因而隨著水解所致的兩性離子基團(tuán)的脫落，抗菌效果逐漸減弱。

圖13 透析0 d(a),12 d(b),96 d(c)時(shí)PDMAPS的抗菌效果，(d)為空白對照

3 結(jié)論

PDMAPS和PDMMPPS 2種兩性離子聚合物分別含有酯鍵和酰胺鍵。本研究表明：酯鍵對堿敏感，在酸中存在一定的水解，而在常溫中性溶液中較為穩(wěn)定。在常溫透析水解過程中，通過不斷地除去水解產(chǎn)生的小分子，能夠促進(jìn)水解緩慢進(jìn)行，雖然水解速率較慢，但在100 d時(shí)水解率也可以達(dá)到21%左右。這說明酯鍵的水解是一個(gè)平衡反應(yīng)，當(dāng)除去水解產(chǎn)物小分子時(shí)，平衡正向進(jìn)行；同時(shí)解釋了為什么酯鍵對堿更為敏感，因?yàn)椴糠炙獾木酆衔锂a(chǎn)生的羧基容易結(jié)合OH-，從而阻礙了逆向反應(yīng)的進(jìn)行。而酰胺鍵則恰恰相反，對酸更為敏感，在中性乃至堿性條件下幾乎不水解。80℃下的水解結(jié)果說明，酰胺鍵通常較為穩(wěn)定，在高溫條件下水解趨勢也不是很明顯，相比之下，酯鍵的穩(wěn)定性要差很多。

透析水解的XPS結(jié)果是對核磁結(jié)果的一個(gè)有力佐證，進(jìn)一步說明了PDMAPS在NaCl溶液中存在緩慢水解?？咕鷮?shí)驗(yàn)結(jié)果直觀地反映了水解之后，隨著酯鍵的斷裂，兩性離子基團(tuán)脫落，聚合物抗菌能力下降。

圖14 PDMAPS常溫透析水解前后的抗菌條形圖