回交導(dǎo)入系稻瘟病抗性鑒定評(píng)價(jià)與分子檢測(cè)分析

梁云濤，王 英，陳傳華，顏 群，徐建龍*，黎志康*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程，北京 100081；2. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，廣西 南寧 530007；3. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】水稻是全世界超過50 %人口的主糧，也是我國(guó)的第一大糧食作物[1-2]。水稻在種植過程中會(huì)遭受到多種病蟲的危害，其中，由真菌Magnaportheoryzae引起的稻瘟病是影響水稻生產(chǎn)最嚴(yán)重的病害之一[3-5]。稻瘟病在所有稻作區(qū)均有發(fā)生，科學(xué)家們采用例如化學(xué)控制、病情預(yù)測(cè)、改進(jìn)栽培方法等各種途徑來控制稻瘟病的發(fā)生，然而效果并不理想。目前，施用農(nóng)藥是控制稻瘟病爆發(fā)的主要方式之一，但是該方法不僅成本高、破壞環(huán)境，而且容易誘發(fā)病菌抗藥性，從而導(dǎo)致病害再次爆發(fā)。長(zhǎng)期實(shí)踐已經(jīng)證明，利用寄主抗性是控制病害最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。因此，發(fā)掘高抗稻瘟病的水稻種質(zhì)資源和培育優(yōu)良抗病水稻品種成為了控制稻瘟病發(fā)生最重要的措施?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，有關(guān)研究人員已篩選或培育出一批抗稻瘟病的水稻材料和品種(系)。黃富等[6]從4萬多份水稻種質(zhì)資源中鑒定評(píng)價(jià)出200多份抗稻瘟病材料，并育成了27個(gè)抗病品種(組合)。張致力等[7]育成了抗稻瘟病雜交稻組合陵優(yōu)2號(hào)。另外，育種家們通過采取輻射育種、細(xì)胞育種等新技術(shù)，創(chuàng)制出包括浙101、DH104、H24和成恢448等一批高抗稻瘟病的水稻新材料[8-11]。應(yīng)用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)培育了抗稻瘟病的不育系金23A和保持系金山B-1[12-13]。這些抗病材料的成功選育對(duì)控制稻瘟病的發(fā)生起到了積極的作用。然而，稻瘟病病菌生理小種復(fù)雜、多變，導(dǎo)致抗病品種一般推廣3～5年就會(huì)逐步減弱或完全喪失其抗病性。另外，許多高抗稻瘟病的優(yōu)良水稻材料由于存在不良性狀的連鎖累贅，因而難以在育種生產(chǎn)中應(yīng)用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】快速、有效地培育出既高抗稻瘟病又兼具優(yōu)良綜合農(nóng)藝性狀的水稻新品種就成為當(dāng)前水稻育種中亟待解決的重要科學(xué)問題?；亟挥N策略不僅能保留輪回親本絕大部分的優(yōu)良性狀特征，而且可以有效改良目標(biāo)性狀的表現(xiàn)，是進(jìn)行水稻抗病改良重要途徑之一?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采取回交育種策略，構(gòu)建以雜交稻恢復(fù)系測(cè)253和桂649為輪回親本的回交導(dǎo)入系，通過自然誘發(fā)和人工接種方式對(duì)導(dǎo)入系進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定評(píng)價(jià)，最終獲得具有廣譜高抗稻瘟病和優(yōu)良農(nóng)藝性狀的新恢復(fù)系，同時(shí)使用分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)導(dǎo)入系群體中供體親本基因組片段分離情況，從而為水稻育種提供優(yōu)質(zhì)抗病親本和水稻抗病基因組研究提供分子證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 回交導(dǎo)入系的構(gòu)建

以秈稻恢復(fù)系C253(測(cè)253)和G649(桂649)為輪回親本，分別與來自不同地區(qū)的水稻品種AZD(AiZiDAO)、HNK(Hnankar)和YTZ(爺駝崽)雜交、回交產(chǎn)生6個(gè)BC1F1群體。然后，從每個(gè)BC1F1群體中隨機(jī)挑選25個(gè)單株為父本，繼續(xù)與各自輪回親本進(jìn)行回交，每個(gè)組合各產(chǎn)生25個(gè)BC2F1株系。種植BC2F1群體，單株逐株混收BC2F2種子。每個(gè)回交群體連續(xù)種植3代，每代隨機(jī)種植500個(gè)單株，成熟期逐株混收自交種子，最終成功培育出C253/AZD(A群體)、C253/HNK(B群體)、C253/YTZ(C群體)、G649/AZD(D群體)、G649/HNK(E群體)和G649/YTZ(F群體)等6個(gè)BC2F5回交導(dǎo)入系群體。

1.2 稻瘟病成株期抗性鑒定評(píng)價(jià)

分別在廣西金秀縣和東興市建立2個(gè)稻瘟病自然誘發(fā)鑒定圃。鑒定圃周邊氣候環(huán)境具有高溫、高濕等特點(diǎn)。由于氣候環(huán)境條件適宜，稻瘟病常年發(fā)生。參照《水稻種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》中的技術(shù)方法開展稻瘟病抗性鑒定評(píng)價(jià)，將穗頸瘟率≤5.0 %的水稻植株定為穗莖瘟抗病單株。

2011年晚造，在金秀縣鑒定圃內(nèi)種植BC2F5導(dǎo)入系群體，每群體種植1000個(gè)單株。同時(shí)種植親本材料，以及在導(dǎo)入系群體四周和中間種植感病水稻品種GJ1(桂井1號(hào))用于誘發(fā)稻瘟病。以水稻品種GJ1充分發(fā)病為標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查試驗(yàn)材料的穗頸瘟率，篩選抗病單株，收獲其自交種子。

2012年早造，將上一年篩選到的抗病導(dǎo)入系BC2F6株系同時(shí)分別種植于金秀和東興鑒定圃。每個(gè)導(dǎo)入系株系和親本均設(shè)2次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，每一重復(fù)種2行，每行12株；行株距為20 cm×17 cm。在試驗(yàn)田中間和四周種植GJ1。在整個(gè)生育過程中，按照常規(guī)水稻種植栽培技術(shù)規(guī)程進(jìn)行田間管理，不噴施任何殺菌劑。在成熟期，以GJ1充分發(fā)病為準(zhǔn)，開始調(diào)查株系小區(qū)中間20個(gè)單株的穗頸瘟率。將2個(gè)重復(fù)的穗頸瘟率平均值定為株系表型值。

1.3 稻瘟病苗期鑒定評(píng)價(jià)

利用稻瘟病A群生理小種ZA1菌株對(duì)導(dǎo)入系植株進(jìn)行苗葉瘟的抗性鑒定。鑒定評(píng)價(jià)方法參照顏群等[14]的方法進(jìn)行。

1.4 田間試驗(yàn)

2012年早造，在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所(南寧)試驗(yàn)田種植183份2011年晚造篩選到的抗稻瘟病導(dǎo)入系株系。根據(jù)田間表現(xiàn)和考種結(jié)果，挑選出綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良株系41份。2012年晚造，以輪回親本和優(yōu)良導(dǎo)入系為父本，分別與不育系特A配組雜交。2013年早造，種植F1雜交后代，進(jìn)行測(cè)產(chǎn)評(píng)價(jià)。同時(shí)種植雜交稻對(duì)照品種特優(yōu)63。所有田間試驗(yàn)均按水田常規(guī)栽培管理，設(shè)2次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，每重復(fù)種1行，每行12株，株行距為20 cm×17 cm。取2次重復(fù)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值為性狀表型值。

植株籽粒成熟后，從每行水稻材料中間選取5個(gè)代表單株，調(diào)查包括單株籽粒產(chǎn)量、株高、單株有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、穗長(zhǎng)以及千粒重等產(chǎn)量相關(guān)性狀的表型值，取其平均值為株系性狀值。

1.5 SSR標(biāo)記檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析

水稻材料DNA的提取參照McCouch等[15]的方法進(jìn)行。選取均勻分布于水稻12條染色體上的650個(gè)SSR分子標(biāo)記為篩選標(biāo)記，在親本G649和TYZ之間進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，最終篩選到多態(tài)性標(biāo)記52個(gè)。根據(jù)Gramene網(wǎng)站公布的標(biāo)記信息，確定SSR標(biāo)記在水稻染色體上的物理位置。然后，使用52個(gè)多態(tài)標(biāo)記檢測(cè)導(dǎo)入系隨機(jī)群體和選擇群體單株的基因型。

表1 2011年導(dǎo)入系稻瘟病抗性篩選結(jié)果

應(yīng)用SAS V8.1軟件PROC GLM程序進(jìn)行表型性狀的方差分析。采用Z測(cè)驗(yàn)法進(jìn)行相同遺傳背景導(dǎo)入系群體之間抗病植株篩選率的差異顯著性分析[16]。

1.6 導(dǎo)入系等位基因的分子檢測(cè)

田間種植BC2F5世代的G649/YTZ回交導(dǎo)入系群體，從中隨機(jī)挑選60個(gè)植株，單株收種，從而構(gòu)建成BC2F6世代的隨機(jī)群體。17個(gè)抗ZA1菌株的G649/YTZ導(dǎo)入系株系組成抗病選擇群體。

分別統(tǒng)計(jì)隨機(jī)群體和抗病選擇群體中各標(biāo)記位點(diǎn)上不同等位基因型分布頻率。將隨機(jī)群體的基因型分布頻率確定為期望值，進(jìn)行卡方顯著性檢測(cè)，分析抗病選擇群體的基因型偏分離情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 導(dǎo)入系群體穗頸瘟抗性評(píng)價(jià)

2011年晚造，金秀鑒定圃內(nèi)試驗(yàn)材料稻瘟病發(fā)病嚴(yán)重感病對(duì)照GJ1平均穗頸瘟率達(dá)到100 %，輪回親本C253和G649平均穗頸瘟率分別為63.0 %和68.0 %。表1數(shù)據(jù)分析表明，從A、B、C、D、E和F等6個(gè)導(dǎo)入系群體中共篩選到抗病單株183份(穗頸瘟率≤5.0 %)，抗病植株篩選率為3.05 %。A、B和C等3個(gè)導(dǎo)入系群體(輪回親本是C253)的平均抗病單株篩選率為2.27 %；D、E和F等 3個(gè)群體(輪回親本是G649)的平均抗病單株篩選率為3.83 %。G649遺傳背景的導(dǎo)入系平均穗頸瘟率為46.7 %，C253遺傳背景的導(dǎo)入系平均穗頸瘟率為58.2 %?？梢?，G649遺傳背景導(dǎo)入系具有更好的抗病性表現(xiàn)。分析還發(fā)現(xiàn)，以C253為背景的3個(gè)導(dǎo)入系群體(A、B、C群體)間的抗病單株篩選比率存在明顯差異，反觀G649遺傳背景的3個(gè)導(dǎo)入系群體(D、E、F群體)間的抗病單株篩選比率差異不大。上述試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同遺傳背景的導(dǎo)入系群體的稻瘟病抗性表現(xiàn)不盡相同。另外，F(xiàn)群體(G649/YTZ)抗病單株篩選率為4.30 %，在所有導(dǎo)入系群體中最高；而A群體(C253/AZD)抗病單株篩選率最低，僅為1.20 %。

在2012年早造，金秀和東興鑒定圃中的試驗(yàn)材料稻瘟病發(fā)病充分，感病對(duì)照GJ1穗頸瘟率均達(dá)到了100 %。在東興鑒定點(diǎn)，輪回親本C253和G649的穗頸瘟率分別為80.5 %和76.5 %，比2011年分別增加了17.5 %和7.50 %；而在金秀鑒定點(diǎn)，C253和G649的穗頸瘟率分別達(dá)到了76.6 %和77.2 %，比上一年分別提高了13.6 %和9.20 %?？梢姡?012年早造上述2個(gè)鑒定點(diǎn)試驗(yàn)材料的稻瘟病發(fā)病程度均高于2011年晚造?？剐员硇头讲罘治鼋Y(jié)果表明(表2)，基因型、環(huán)境以及基因型×環(huán)境互作均達(dá)到極顯著水平?；蛐秃突蛐汀镰h(huán)境互作分別解釋表型變異的79.6 %和14.7 %。說明除了基因型差異是引起株系抗病性不同的主要因素，不同的環(huán)境條件和致病菌株對(duì)導(dǎo)入系抗病性表現(xiàn)也有明顯影響。

2012年早造鑒定結(jié)果表明(表3)，在2個(gè)鑒定點(diǎn)，183份導(dǎo)入系的整體抗病水平均明顯優(yōu)于輪回親本，其中，來自F群體的導(dǎo)入系平均穗莖瘟率都是最低(9.24 %和9.02 %)，也篩選出最多的抗病株系(27和28個(gè))。在東興鑒定點(diǎn)，篩選到69份抗病導(dǎo)入系(穗頸瘟率≤5.0 %)。C253遺傳背景導(dǎo)入系(來源于A、B、C群體)平均穗頸瘟率為18.3 %，比輪回親本減少62.2 %；G649遺傳背景導(dǎo)入系(來源于D、E、F群體)穗頸瘟率平均值為13.2 %，比輪回親本降低了63.3 %。金秀鑒定點(diǎn)，鑒定出80份導(dǎo)入系表現(xiàn)抗病，它們的穗頸瘟率均≤5.0 %。C253遺傳背景導(dǎo)入系平均穗頸瘟率為13.6 %，比輪回親本減少63.0 %；G649遺傳背景導(dǎo)入系的平均穗頸瘟率為12.7 %，比輪回親本減少了64.5 %。在抗病株系當(dāng)中有37.3 %的導(dǎo)入系(68份)在2個(gè)鑒定點(diǎn)均表現(xiàn)抗病(穗頸瘟率≤5.0 %)。

表2 2012年183份BC2F6導(dǎo)入系的穗頸瘟抗性方差分析結(jié)果

表3 2012年183份BC2F6份導(dǎo)入系稻瘟病抗性鑒定結(jié)果

注：N：穗頸瘟率≤5.0 %的株系數(shù)，1：不同字母表示Duncan多重比較結(jié)果(P<0.05)。

Note:N: Number of ILs with panicle blast rate≤5 %, 1: Different letters indicate statistical significance atP<0.05, based on the Duncan testing.

2.2 稻瘟病苗期抗性鑒定評(píng)價(jià)

對(duì)從2個(gè)稻瘟病鑒定圃篩選出均表現(xiàn)穗莖瘟抗病的68份導(dǎo)入系進(jìn)行苗期稻瘟病人工接菌鑒定。結(jié)果顯示(表4)，輪回親本C253和G649抗病等級(jí)分別為6.50和6.0，導(dǎo)入親本AZD、HNK和YTZ抗病等級(jí)分別為3.50、4.0和4.0。來自D群體的導(dǎo)入系抗病等級(jí)平均值最低(2.50)，而來源于C群體的導(dǎo)入系則最高(5.23)。在68份導(dǎo)入系中共鑒定出21份材料的抗病等級(jí)≤3，它們分別來自A、B、D、E和F等5個(gè)導(dǎo)入系群體。從來源于F群體的27份導(dǎo)入系中共鑒定出17份抗病株系，而來自C群體的11份導(dǎo)入系全都表現(xiàn)感病，兩者抗病性表現(xiàn)存在較大差異。由于F和C導(dǎo)入系群體的供體親本均為YTZ，可見供體基因組導(dǎo)入片段在不同遺傳背景中表現(xiàn)并不一樣。由此推測(cè)，外源基因片段的表達(dá)可能受到了不同輪回親本遺傳背景的影響。

表4 68份BC2F6回交導(dǎo)入系苗瘟抗病鑒定結(jié)果

注：N1：抗穗頸瘟株系的數(shù)目，N2：抗苗瘟的株系數(shù)目。

Note：N1：Number of ILs with panicle blast resistance, N2: Number of ILs with seedling blast resistance.

2.3 導(dǎo)入系雜交種的產(chǎn)量及相關(guān)性狀評(píng)價(jià)

2012年早造，從183份抗病導(dǎo)入系中挑選出41份綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系以及它們各自的輪回親本分別與不育系特A進(jìn)行測(cè)交。然后，在2013年早造種植上述進(jìn)行產(chǎn)量性狀評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，導(dǎo)入系株系測(cè)交后代的農(nóng)藝性狀均不同程度優(yōu)于輪回親本測(cè)交種。來自A、B、C群體的20個(gè)株系測(cè)交后代的平均單株產(chǎn)量、平均穗長(zhǎng)、平均穗總粒數(shù)和平均穗實(shí)粒數(shù)比輪回親本C253測(cè)交種分別提高了8.36 %、2.31 %、11.2 %和5.78 %。其中，來自A群體的導(dǎo)入系測(cè)交組合的平均穗實(shí)粒數(shù)顯著(t<0.05)高于輪回親本測(cè)交種。相對(duì)于輪回親本G649的測(cè)交種，來自D、E、F群體21個(gè)株系測(cè)交組合的平均單株產(chǎn)量、平均穗長(zhǎng)、平均穗總粒數(shù)和平均穗實(shí)粒數(shù)分別提高了7.37 %、8.18 %、12.1 %和2.29 %。其中，D和F群體導(dǎo)入系測(cè)交組合平均穗長(zhǎng)顯著(t<0.05)比輪回親本測(cè)交種更長(zhǎng)(表5)。

分別來自A、B、E和F等4個(gè)群體的YA-6、YA-33、YA-11和YA-18等4個(gè)導(dǎo)入系表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)和優(yōu)良的稻瘟病抗性(表6)。它們?cè)诔芍昶诰憩F(xiàn)出良好的抗病性，在2012年2個(gè)鑒定點(diǎn)的抗病鑒定試驗(yàn)中，穗頸瘟率均低于5.0 %。同時(shí)，導(dǎo)入系YA-11和YA-18的苗瘟抗性還達(dá)到了中抗(3級(jí))。在2013年田間試驗(yàn)中，上述優(yōu)良導(dǎo)入系與特A雜交后代表現(xiàn)出優(yōu)良的綜合農(nóng)藝性狀。它們與特A配組F1后代的結(jié)實(shí)率均達(dá)到了85 %以上，平均單株產(chǎn)量達(dá)到38.0 g。4個(gè)導(dǎo)入系雜種后代的單株產(chǎn)量均顯著(t<0.05)高于各自輪回親本雜種后代產(chǎn)量，也明顯高于對(duì)照品種特優(yōu)63的產(chǎn)量(27.8 g)。這表明，上述雜交稻組合具有良好的推廣應(yīng)用前景。

表5 2013年正常水田條件下41份導(dǎo)入系雜交組合的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

注：Pop.: 導(dǎo)入系群體，N：測(cè)交種數(shù)目，黑體字表明根據(jù)t-test與輪回親本測(cè)交種差異達(dá)到顯著水平(<0.05)。

Note：Pop: ILs population, N: Number of hybrids, Bold data represent significantly higher or lower(t<0.05)than recurrent parent.

表6 2013年正常水田條件下4份優(yōu)勢(shì)雜交組合的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

注：Pop.：導(dǎo)入系群體，No.：雜交組合導(dǎo)入系親本編號(hào)，黑體字表明根據(jù)t-test與輪回親本測(cè)交種差異達(dá)到顯著水平(<0.05)，GroupⅠ：導(dǎo)入系親本穗頸瘟率≤5 %以及苗瘟抗病等級(jí)≤3，GroupⅡ：導(dǎo)入系親本穗頸瘟率≤5 %。 Note：Pop: ILs population, No.: Serial number of ILs, Bold data represent significantly higher or lower(t<0.05)than recurrent parent, GroupⅠ: ILs with resistance to rice blast at the seedling and panicle stage, GroupⅡ: ILs with resistance to rice blast at the panicle stage.

表7 導(dǎo)入系群體卡方檢測(cè)分析結(jié)果

2.4 導(dǎo)入系選擇群體的等位基因分布頻率

以F群體的隨機(jī)群體為期望值，利用其極端抗病選擇群體，進(jìn)行卡方檢測(cè)分析，共檢測(cè)到5個(gè)供體親本TYZ基因組片段超導(dǎo)入位點(diǎn)(表7)。這些位點(diǎn)分別位于第1、2、3和9染色體RM10836、RM11160、RM13838、RM3434、RM219等5個(gè)標(biāo)記位置上。與隨機(jī)群體相比，選擇群體在上述位點(diǎn)的TYZ等位基因?qū)腩l率顯著增加。這可能，由于導(dǎo)入系群體經(jīng)過成株期和苗期兩輪的稻瘟病抗性選擇，染色體的多個(gè)位點(diǎn)對(duì)選擇產(chǎn)生了響應(yīng)，導(dǎo)致其響應(yīng)位點(diǎn)上的等位基因出現(xiàn)了明顯的偏分離。

3 討 論

稻瘟病是水稻生產(chǎn)上的一種毀滅性病害。利用寄主抗性是抵御病菌侵害、防治病害發(fā)生最有效的方式。水稻對(duì)稻瘟病的抗性遺傳主要包括兩個(gè)方面：1)垂直抗性，表現(xiàn)為質(zhì)量性狀，受主效基因控制，具有明顯的小種專化表現(xiàn)，其遺傳模式符合典型的“基因-基因”假說；2)水平抗性，表現(xiàn)為數(shù)量性狀，主要受微效多基因/QTL位點(diǎn)控制。截至到2015年，已從栽培稻或野生稻資源中鑒定出84個(gè)抗稻瘟病主效基因，它們分布在除了第3染色體以外的其余11條染色體上的69個(gè)位點(diǎn)上，并克隆了其中的24個(gè)抗稻瘟病基因。(http://www.ricedata.cn)。另外，各國(guó)科學(xué)家利用連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析方法在水稻不同染色體上檢測(cè)到500多個(gè)QTL[17]。但是，上述抗病基因/QTL只有少數(shù)被用于育種實(shí)踐，主要原因是許多抗源材料攜帶有大量不良性狀的連鎖累贅，極大制約了抗病基因的利用。而少數(shù)已被應(yīng)用的稻瘟病抗性基因也因?yàn)榈疚敛【硇》N的改變逐步在生產(chǎn)上喪失抗性。因此，育種家們希望能挖掘出更多優(yōu)異抗稻瘟病基因資源，更快速地培育出符合生產(chǎn)要求的抗病品種，才可以持續(xù)、有效的控制稻瘟病的發(fā)生。而另一方面，在水稻種質(zhì)資源中蘊(yùn)含有豐富的遺傳變異，其中也包含有許多優(yōu)異抗病基因資源，但至今只有少量的有利基因資源被開發(fā)利用，絕大部分仍被“隱藏”在水稻種質(zhì)資源庫(kù)中。如何充分利用這些寶貴的基因資源已成為當(dāng)前亟待解決的重要科學(xué)難題。各國(guó)科學(xué)家正努力探索尋找出一種高效的技術(shù)途徑可以從豐富的水稻遺傳資源中挖掘出稻瘟病抗性基因，并能迅速將其應(yīng)用于水稻育種實(shí)踐。研究表明，通過采用回交育種策略，大規(guī)模地將水稻種質(zhì)資源中的優(yōu)異基因?qū)氲骄C合性狀優(yōu)良的水稻品種遺傳背景中，然后經(jīng)過嚴(yán)格的表型篩選，可以高效挖掘出許多目標(biāo)性狀突出的優(yōu)異基因資源[18-23]。而且，由于導(dǎo)入系繼承了輪回親本大部分的優(yōu)良特性，打破了不良性狀的連鎖累贅，因而篩選出的導(dǎo)入系可以直接應(yīng)用于生產(chǎn)，或作為親本用于育種。優(yōu)質(zhì)雜交稻恢復(fù)系C253和G649具有綜合農(nóng)藝性狀突出、配合力高等優(yōu)點(diǎn)，它們組配的雜交稻品種已在華南稻區(qū)大面推廣應(yīng)用。然而，由于這兩個(gè)恢復(fù)系的稻瘟病抗性較差，難以進(jìn)一步發(fā)揮它們的育種優(yōu)勢(shì)。為此，本研究以C253和G649為輪回親本，分別與3個(gè)與其遺傳差異較大的水稻品種進(jìn)行雜交、回交，構(gòu)建回交導(dǎo)入系材料，通過稻瘟病抗性鑒定評(píng)價(jià)，篩選出穗期和苗期均表現(xiàn)抗病的優(yōu)良導(dǎo)入系21個(gè)?？共?dǎo)入系不僅表現(xiàn)出廣譜、高抗稻瘟病，而且由于具有輪回親本優(yōu)良的遺傳背景，直接從中成功選育出了高配合力的優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系，這也再次證明，回交育種方法是一種能高效挖掘目標(biāo)基因、快速培育水稻新品種的有力工具。而且，回交導(dǎo)入系可以成為一個(gè)發(fā)掘水稻有利基因和育種親本的資源平臺(tái)，為育種應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供材料支撐。

表型鑒定是抗病基因挖掘和抗病品種選育能否成功的關(guān)鍵。采用何種鑒定方法將會(huì)直接影響篩選表型的準(zhǔn)確性。稻瘟病鑒定主要包括自然誘發(fā)和人工接種鑒定2種。人工接種鑒定可以在人為控制條件下進(jìn)行稻瘟病發(fā)病試驗(yàn)，因此實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，但是工作量大，難以開展大規(guī)模鑒定評(píng)價(jià)。自然誘發(fā)鑒定是在自然氣候條件下，由自然界中的稻瘟病菌侵染發(fā)生，其發(fā)病情況更能反映水稻種植生產(chǎn)的實(shí)際，更具有客觀性。然而，自然誘發(fā)鑒定容易受環(huán)境氣候變化的影響導(dǎo)致發(fā)病不夠穩(wěn)定。因此，需要進(jìn)行不同地點(diǎn)的重復(fù)鑒定才能保證鑒定的準(zhǔn)確性。本研究針對(duì)不同鑒定方法的優(yōu)缺點(diǎn)，將兩種方法有機(jī)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)兩方優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，保證了鑒定評(píng)價(jià)的有效、準(zhǔn)確，成功篩選出廣譜、高抗的優(yōu)良抗病材料。

分子標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入系選擇群體在1、2、3、9染色體上5個(gè)位點(diǎn)的等位基因發(fā)生了顯著偏分離。這說明，在稻瘟病抗性定向選擇的壓力作用下，與選擇相關(guān)的染色體位點(diǎn)上的等位基因遺傳多樣性將會(huì)發(fā)生改變，對(duì)選擇有利的等位基因以及與之緊密連鎖的基因組區(qū)段的頻率將會(huì)顯著上升?？梢赃M(jìn)一步推測(cè)，這些發(fā)生偏分離的基因組區(qū)段極有可能就是影響水稻稻瘟病抗性的QTL位點(diǎn)。因此，這些區(qū)段將是今后開展水稻抗病基因組學(xué)研究應(yīng)該關(guān)注的重點(diǎn)區(qū)域。但是，由于本研究篩選到的多態(tài)分子標(biāo)記相對(duì)較少，因此能檢測(cè)到與抗病選擇相關(guān)的分子標(biāo)記不多，導(dǎo)致難以精準(zhǔn)確定選擇偏分離染色體區(qū)段的具體范圍。因此，需要通過今后進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，篩選出足夠數(shù)量的多態(tài)分子標(biāo)記才能準(zhǔn)確分析上述抗病選擇位點(diǎn)與已知稻瘟病抗性基因/QTL的相互關(guān)系。

4 結(jié) 論

本研究采用回交育種策略，通過對(duì)6個(gè)回交導(dǎo)入系群體進(jìn)行稻瘟病鑒定評(píng)價(jià)，成功篩選出抗穗頸瘟導(dǎo)入系47個(gè)，兼抗穗頸瘟和苗葉瘟的抗病導(dǎo)入系21個(gè)，最終獲得抗病性強(qiáng)、配合力高的雜交稻恢復(fù)系4個(gè)，并且分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5個(gè)染色體位點(diǎn)等位基因發(fā)生了顯著偏分離。這些研究結(jié)果可以為今后水稻抗病育種和基因組研究提供了材料保障和理論依據(jù)。